呼吸道病毒疫苗
| 發明專利說明書 |
| ※申請案號：105134198 | ※I P C 分類： | |
| 【發明名稱】(中文/英文) |
| 呼吸道病毒疫苗 |
| RESPIRATORY VIRUS VACCINES |
| 【中文】 |
| 本發明係關於呼吸道病毒核糖核酸(RNA)疫苗及組合疫苗，以及使用該等疫苗之方法及包含該等疫苗之組合物。 |
| 【英文】 |
| The disclosure relates to respiratory virus ribonucleic acid (RNA) vaccines and combination vaccines, as well as methods of using the vaccines and compositions comprising the vaccines. |
| 【代表圖】 |
| 【本案指定代表圖】： 第1圖 |
| 【本代表圖之符號簡單說明】： |
| 【本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式】： |
| 發明說明 | |
| 【技術領域】 | |
| 【先前技術】 | |
| [0001] | 本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)主張2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/244,802號、2015年10月28日申請之美國臨時申請案第62/247,297號、2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/244,946號、2015年10月28日申請之美國臨時申請案第62/247,362號、2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/244,813號、2015年10月28日申請之美國臨時申請案第62/247,394號、2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/244,837號、2015年10月28日申請之美國臨時申請案第62/247,483號及2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/245,031號之權益，該等臨時申請案各自以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0002] | 呼吸道疾病為涵蓋影響可能在高等生物體內進行氣體交換之器官及組織之病理學狀況的醫學術語，且包括上呼吸道、氣管、支氣管、細支氣管、肺泡、胸膜及胸膜腔以及呼吸神經及肌肉之病況。呼吸道疾病範圍為輕度及自我限制(諸如普通感冒)至威脅生命之實體，如細菌性肺炎、肺栓塞、急性哮喘及肺癌。呼吸道疾病在全世界範圍內為一種常見且重要之疾病及死亡原因。在美國，每年約有10億人發生「普通感冒」。呼吸道病況為兒童住院 之最常見原因。 |
| [0003] | 人類偏肺病毒(hMPV)為肺病毒亞科(Pneumovirinae)屬及副黏液病毒(Paramyxoviridae)科之負義單股RNA病毒，且與禽類偏肺病毒(AMPV)C亞群密切相關。其在2001年在荷蘭藉由使用RAP-PCR(RNA任意引物PCR)技術首次分離用以標識在培養細胞中生長之未知病毒。hPMV僅次於RSV作為幼兒中之病毒性下呼吸道疾病(LRI)之重要原因。hMPV之季節性流行病學似乎與RSV類似，但感染及疾病之發生率似乎實質上更低。 |
| [0004] | 第3型副流行性感冒病毒(PIV3)如同hMPV，亦為肺病毒亞科屬及副黏液病毒科之負義、單股RNA病毒，且為嬰幼兒中廣泛存在之急性呼吸道感染的重要原因。其發生率在約4至12個月齡中達到 值，且該病毒致使3至10%住院治療，主要由於支氣管炎及肺炎。PIV3可為致命的，且在某些情形下與諸如熱性癲癇發作之神經性疾病相關。其亦可導致氣道重塑，此為發病之重要原因。在世界上之發展中地區，嬰幼兒存在最高發病風險，源於原發性PIV3病毒感染或繼發性後果，諸如細菌感染。人類第1型、第2型及第3型副流行性感冒病毒(hPIV)(分別為hPIV1、hPIV2及hPIV3)亦如同hMPV，僅次於RSV作為幼兒中病毒性LRI之重要原因。 |
| [0005] | RSV亦為肺病毒亞科屬及副黏液病毒科之負義、單股RNA病毒。成人之症狀通常類似於鼻竇感染或普通感冒，儘管感染可能無症狀。在老年人(例如，>60歲)中，RSV感染可發展成支氣管炎或肺炎。兒童之症狀常更為嚴重，包括支氣管炎及肺炎。在美國，估計大多數兒童在三歲之前均感染過RSV。RSV病毒粒子由包含與核蛋白(N)、磷蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)結合之病毒性RNA之內部核鞘組成。核鞘由基質蛋白(M)包圍且由其中合併有病毒融合體(F)及附著(G)蛋白以及小疏水性蛋白(SH)之脂質雙層 囊封。病毒基因體亦編碼兩種非結構性蛋白(NS1及NS2)，其抑制I型干擾素活性以及M-2蛋白。 |
| [0006] | 與hMPV、PIV3及RSV相關之持續性健康問題受到國際關注，加強了研發針對該等病毒之有效且安全之疫苗候選物的重要性。 |
| [0007] | 儘管已進行數十年研究，但目前仍無疫苗(Sato及Wright,Pediatr.Infect.Dis.J.2008；27(10增刊)：S123-5)。然而，已使用重組技術來標靶例如用於hPIV-1、2及3血清型之疫苗的資訊，且已採用若干種活減毒鼻內疫苗之形式。特定而言，已發現兩種疫苗具有免疫原性且在I期試驗中對hPIV-3良好耐受。hPIV1及hPIV2疫苗候選物仍不夠先進(Durbin及Karron,Clinical infectious diseases：an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2003；37(12)：1668-77)。 |
| [0008] | 麻疹病毒(MeV)如同hMPV、PIV3及RSV，為一種導致麻疹(一種呼吸道系統感染)之負義單股RNA病毒。MeV屬於副黏液病毒科中之麻疹病毒(Morbillivirus)屬。人類為病毒之天然宿主；已知不存在動物傳染窩(reservoir)。麻疹之症狀包括發燒、咳嗽、流鼻涕、紅眼及全身性斑丘疹、紅斑疹。該病毒具有高度傳染性且藉由咳嗽傳播。 |
| [0009] | 除hMPV、PIV、RSV及MeV以外，已知β冠狀病毒導致呼吸道疾病。β冠狀病毒(βCoV)為尼多病毒目(Nidovirale)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒亞科(Coronavirinae)之四種冠狀病毒屬之一。其為動物傳染病來源之包膜正義單股RNA病毒。冠狀病毒屬各自包含不同之病毒譜系，其中β冠狀病毒屬含有四種該等譜系。最受臨牀上重要關注之人類之βCoV為A譜系之OC43及HKU1、B譜系之SARS-CoV及C譜系之MERS-CoV。MERS-CoV為 已知感染人類之屬於譜系C之第一β冠狀病毒。 |
| [0010] | 在對2012年新流感爆發期間生病之人的痰樣品分離之病毒進行基因體測序後，在2012年首次報導中東呼吸道徵候群冠狀病毒(MERS-CoV)或EMC/2012(HCoV-EMC/2012)，最初稱為新穎冠狀病毒2012或簡稱為新穎冠狀病毒。截至2015年7月，已在超過21個國家報導MERS-CoV病例。MERS-CoV之爆發已在世界範圍內引起深切關注，增強了研發對抗MERS-CoV之有效且安全之疫苗候選物的重要性。 |
| [0011] | 嚴重急性呼吸道徵候群(SARS)在2002年在中國出現且在受到控制之前傳播至其他國家。由於對SARS冠狀病毒再度出現或故意釋放之關注，開始研發疫苗。 |
| [0012] | 去氧核糖核酸(DNA)疫苗接種為一種用於刺激對外來抗原之體液及細胞免疫反應之技術，該等外來抗原諸如hMPV抗原及/或PIV抗原及/或RSV抗原。直接向活宿主體內注射基因工程化DNA(例如，裸質體DNA)導致其小量細胞直接產生抗原，從而導致保護性免疫學反應。然而，使用此技術發生潛在問題，包括可能發生插入誘變，此可導致致癌基因活化或對腫瘤抑制基因之抑制作用。 |
| 【發明內容】 | |
| [0013] | 本文提供核糖核酸(RNA)疫苗，其建立在以下認知之上，即RNA(例如，信使RNA(mRNA))可安全地引導身體之細胞機制從而自天然蛋白至抗體產生幾乎任何所關注之蛋白及在細胞內外可具有治療活性之其他完全新穎之蛋白構築體。本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可用於誘發針對hMPV、PIV、RSV、MeV及/或βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)或 |
| [0014] | 兩種或兩種以上上述病毒之任意組合的平衡免疫反應，該平衡免疫反應包含細胞及體液免疫性，而無例如插入誘變可能性之風險。hMPV、PIV、RSV、MeV、βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)及其組合在本文中稱為「呼吸道病毒」。因此，術語「呼吸道病毒RNA疫苗」涵蓋hMPV RNA疫苗、PIV RNA疫苗、RSV RNA疫苗、MeV RNA疫苗、βCoV RNA疫苗及兩種或兩種以上hMPV RNA疫苗、PIV RNA疫苗、RSV RNA疫苗、MeV RNA疫苗及βCoV RNA疫苗之任意組合。 |
| [0015] | RNA(例如，mRNA)疫苗視感染之盛行率或未滿足之醫學需要的程度或水準而可用於各種情境中。RNA(例如，mRNA)疫苗可用於治療及/或預防各種基因型、菌株及分離株之hMPV、PIV、RSV、MeV、βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上述病毒之任意組合。RNA(例如，mRNA)疫苗之優越特性在於其與市售之抗病毒治療處理相比產生大得多之抗體效價且更早地產生反應。儘管不希望受理論約束，但咸信RNA(例如，mRNA)疫苗，如同mRNA聚核苷酸，經更佳設計以在RNA(例如，mRNA)疫苗指派天然細胞機制時經轉譯而產生適當之蛋白構型。與離體製造且可觸發不利細胞反應之傳統疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然之方式提供給細胞系統。 |
| [0016] | 在一些態樣中，本發明為一種呼吸道病毒疫苗，其包含至少一種具有編碼至少一種呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸，調配於陽離子脂質奈米粒子中。 |
| [0017] | 令人驚訝地，在一些態樣中，亦證實在與鞭毛蛋白佐劑組合 時，尤其當一或多種編碼抗原之mRNA與編碼鞭毛蛋白之mRNA組合時，mRNA疫苗之功效可顯著增強。 |
| [0018] | 與鞭毛蛋白佐劑(例如，經mRNA編碼之鞭毛蛋白佐劑)組合之RNA(例如，mRNA)疫苗之優越特性在於其與市售之疫苗調配物相比產生大得多之抗體效價且更早地產生反應。儘管不希望受理論約束，但咸信RNA(例如，mRNA)疫苗，例如如同mRNA聚核苷酸，經更佳設計以在RNA(例如，mRNA)疫苗指派天然細胞機制時經轉譯而產生適當之蛋白構型(對於抗原及佐劑而言)。與離體製造且可觸發不利細胞反應之傳統疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然之方式提供給細胞系統。 |
| [0019] | 本發明之一些實施例提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能夠誘發對抗原性多肽之免疫反應之免疫原性片段)之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸及至少一種具有編碼鞭毛蛋白佐劑之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA聚核苷酸)。 |
| [0020] | 在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽(例如，經編碼之鞭毛蛋白多肽)為鞭毛蛋白。在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽(例如，經編碼之鞭毛蛋白多肽)為免疫原性鞭毛蛋白片段。在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽及至少一種抗原性多肽由單一RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼。在其他實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽及至少一種抗原性多肽各自由不同之RNA聚核苷酸編碼。 |
| [0021] | 在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽與具有由SEQ ID NO：54至56中任一者標識之序列之鞭毛蛋白多肽具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之一致性。 |
| [0022] | 在一些實施例中，本文提供一種核糖核酸(RNA)(例如， mRNA)疫苗，其包含至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)hMPV、PIV、RSV、MeV或βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)抗原性多肽或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合之開放閱讀框架。本文中，除非另外規定，否則使用術語「抗原性多肽」涵蓋抗原性多肽之免疫原性片段(對hMPV、PIV、RSV、MeV或βCoV誘發(或能夠誘發)免疫反應之免疫原性片段)。 |
| [0023] | 在一些實施例中，本文亦提供一種RNA(例如，mRNA)疫苗，其包含至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)RNA聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)hMPV、PIV、RSV、MeV及/或βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其連接至信號肽。 |
| [0024] | 在一些實施例中，本文進一步提供一種核酸(例如，DNA)，其編碼至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)hMPV、PIV、RSV、MeV及/或βCoV(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0025] | 在一些實施例中，本文又進一步提供一種在個體中誘發免疫反應之方法，該方法包括向個體投與包含至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之疫苗，該聚核苷酸具有編碼至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)hMPV、PIV、RSV、MeV及/或βCoV(例如，MERS-CoV、SARS- CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)抗原性多肽或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合之開放閱讀框架。 |
| [0026] | hMPV/PIV3/RSV |
| [0027] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一種具有編碼至少一種hMPV、PIV3或RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為hMPV、PIV3或RSV多蛋白。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為主要表面醣蛋白G或其免疫原性片段。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為融合(F)醣蛋白(例如，融合醣蛋白F0、F1或F2)或其免疫原性片段。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為主要表面醣蛋白G或其免疫原性片段及F醣蛋白或其免疫原性片段。在一些實施例中，抗原性多肽為核蛋白(N)或其免疫原性片段、磷蛋白(P)或其免疫原性片段、大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段、基質蛋白(M)或其免疫原性片段、小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段、非結構蛋白1(NSI)或其免疫原性片段或非結構蛋白2(NS2)及其免疫原性片段。 |
| [0028] | 在一些實施例中，至少一種hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列(表3；亦參見表4之胺基酸序列)。在一些實施例中，hMPV抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列(表3；亦參見表4之胺基酸序列)，或為由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列(表3；亦參見表4之胺基酸序列)之片段，或為與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列(表3；亦參見表4之胺基酸序列)具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0029] | 在一些實施例中，至少一種hMPV抗原性多肽由SEQ ID NO：1至4(表2)中任一者標識之核酸序列編碼。 |
| [0030] | 在一些實施例中，至少一種hMPV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸由SEQ ID NO：1至4(表2)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段編碼。在一些實施例中，至少一種hMPV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸包含SEQ ID NO：57至60(表2)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段。 |
| [0031] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由hMPV菌株CAN98-75(CAN75)或hMPV菌株CAN97-83(CAN83)獲得。 |
| [0032] | 在一些實施例中，至少一種PIV3抗原性多肽包含血球凝集素-神經胺糖酸酶、融合(F)醣蛋白、基質蛋白(M)、核鞘蛋白(N)、病毒複製酶(L)、非結構V蛋白或其免疫原性片段。 |
| [0033] | 在一些實施例中，至少一種PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列(表6；亦參見表7之胺基酸序列)。在一些實施例中，PIV3抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列(表6；亦參見表7之胺基酸序列)，或為由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列(表6；亦參見表7之胺基酸序列)之片段，或為與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列(表6；亦參見表7之胺基酸序列)具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0034] | 在一些實施例中，至少一種PIV3抗原性多肽由SEQ ID NO：9至12中任一者標識之核酸序列(表5；亦參見表7之核酸序列)編碼。 |
| [0035] | 在一些實施例中，至少一種PIV3 RNA(例如，mRNA)聚核苷酸由SEQ ID NO：9至12中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片 段(表5；亦參見表7之核酸序列)編碼。在一些實施例中，至少一種PIV3 RNA(例如，mRNA)聚核苷酸包含由SEQ ID NO：61至64(表5)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段。 |
| [0036] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由PIV3菌株HPIV3/智人/PER/FLA4815/2008獲得。 |
| [0037] | 在一些實施例中，至少一種RSV抗原性多肽包含至少一種抗原性多肽，其包含醣蛋白G、醣蛋白F或其免疫原性片段。在一些實施例中，至少一種RSV抗原性多肽包含至少一種包含醣蛋白F之抗原性多肽及至少一種或至少兩種選自G、M、N、P、L、SH、M2、NS1及NS2之抗原性多肽。 |
| [0038] | MeV |
| [0039] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一種具有編碼至少一種MeV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為血球凝集素(HA)蛋白或其免疫原性片段。HA蛋白例如可來自MeV菌株D3或B8。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為融合(F)蛋白或其免疫原性片段。F蛋白例如可來自MeV菌株D3或B8。在一些實施例中，MeV RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一種編碼HA蛋白及F蛋白之RNA聚核苷酸。HA及F蛋白例如可來自MeV菌株D3或B8。 |
| [0040] | 在一些實施例中，至少一種MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50(表14)中任一者標識之胺基酸序列。在一些實施例中，MeV抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：47至50(表14)中任一者標識之胺基酸序列、或為由SEQ ID NO：47至50(表14)中任一者標識之胺基酸序列之片段，或為與由SEQ ID NO：47至50(表14)中任一者標識之胺基酸序列具有至少80%(例如， 85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0041] | 在一些實施例中，至少一種MeV抗原性多肽由SEQ ID NO：35至46(表13)之核酸序列編碼。 |
| [0042] | 在一些實施例中，至少一種MeV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸由SEQ ID NO：35至46(表13)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段編碼。在一些實施例中，至少一種MeV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸包含由SEQ ID NO：69至80(表13)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段。 |
| [0043] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由MeV菌株B3/B3.1、C2、D4、D6、D7、D8、G3、H1、Moraten、Rubeovax、MVi/紐澤西.美國/45.05、MVi/德克薩斯.美國/4.07、AIK-C、MVi/紐約.美國/26.09/3、MVi/加利福尼亞.美國/16.03、MVi/弗吉尼亞.美國/15.09、MVi/加利福尼亞.美國/8.04或MVi/賓夕法尼亞.美國/20.09獲得。 |
| [0044] | βCoV |
| [0045] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一種具有編碼至少一種βCoV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，βCoV為MERS-CoV。在一些實施例中，βCoV為SARS-CoV。在一些實施例中，βCoV為HCoV-OC43。在一些實施例中，βCoV為HCoV-229E。在一些實施例中，βCoV為HCoV-NL63。在一些實施例中，βCoV為HCoV-HKU1。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為β冠狀病毒結構蛋白。例如，β冠狀病毒結構蛋白可為刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核鞘蛋白(N)、膜蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，β冠狀病毒結構蛋白為刺突蛋白(S)。在一些實施例中，β冠狀病毒結構蛋白為刺突蛋白(S)或其免疫原性片段之S1次單位或S2 次單位。 |
| [0046] | 本文提供之疫苗之βCoV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸可編碼β冠狀病毒之病毒蛋白組分，例如本發明涵蓋輔助蛋白、複製酶蛋白及其類似物。RNA(例如，mRNA)疫苗可包括編碼至少一種輔助蛋白(例如，蛋白3、蛋白4a、蛋白4b、蛋白5)、至少一種複製酶蛋白(例如，蛋白1a、蛋白1b)或至少一種輔助蛋白與至少一種複製酶蛋白之組合的RNA聚核苷酸。本發明亦涵蓋包含編碼與至少一種結構蛋白組合之輔助蛋白及/或複製酶蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的RNA(例如，mRNA)疫苗。由於其表面表現特性，咸信以編碼結構蛋白之RNA聚核苷酸為特徵之疫苗具有較佳之免疫原性活性，且因此可最適合用於本發明之疫苗中。 |
| [0047] | 本發明之一些實施例提供β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1或其組合)疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH、HCoV-HKU1)抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。本文亦提供廣泛β冠狀病毒疫苗。因此，包含具有編碼MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63及HCoV-HKU1中任一者、兩者、三者或四者之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的β冠狀病毒疫苗例如可有效對抗MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1中之任一者、其任意組合或全部。本發明涵蓋其他β冠狀病毒。 |
| [0048] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為MERS-CoV結構蛋白。例如，MERS-CoV結構蛋白可為刺突蛋白(S)、包膜蛋白 (E)、核鞘蛋白(N)、膜蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，MERS-CoV結構蛋白為刺突蛋白(S)(參見例如Coleman CM等人，Vaccine 2014；32：3169-74，其以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，MERS-CoV結構蛋白為刺突蛋白(S)或其免疫原性片段之S1次單位或S2次單位(Li J等人，Viral Immunol 2013；26(2)：126-32；He Y等人Biochem Biophys Res Commun 2004；324(2)：773-81，其各自以引用之方式併入本文中)。 |
| [0049] | 在一些實施例中，至少一種MERS-CoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至28或33(表11)中任一者標識之胺基酸序列。在一些實施例中，MERS-CoV抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：24至28或33(表11)中任一者標識之胺基酸序列，或為由SEQ ID NO：24至28或33(表11)中任一者標識之胺基酸序列之片段，或為與由SEQ ID NO：24至28或33(表11)中任一者標識之胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0050] | 在一些實施例中，至少一種MERS-CoV抗原性多肽由SEQ ID NO：20至23(表10)中任一者標識之核酸序列編碼。 |
| [0051] | 在一些實施例中，至少一種MERS-CoV RNA(例如，mRNA)聚核苷酸由SEQ ID NO：20至23(表10)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段編碼。在一些實施例中，至少一種MERS-CoVRNA(例如，mRNA)聚核苷酸包含由SEQ ID NO：65至68(表10)中任一者標識之核酸序列或核苷酸序列片段。 |
| [0052] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由MERS-CoV菌株利雅得_14_2013、2cEMC/2012或哈薩_1_2013獲得。 |
| [0053] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為SARS-CoV結構蛋白。例如，SARS-CoV結構蛋白可為刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、 核鞘蛋白(N)、膜蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，SARS-CoV結構蛋白係刺突蛋白(S)。在一些實施例中，SARS-CoV結構蛋白為刺突蛋白(S)或其免疫原性片段之S1次單位或S2次單位。 |
| [0054] | 在一些實施例中，至少一種SARS-CoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：29、32或34(表11)中任一者標識之胺基酸序列。在一些實施例中，SARS-CoV抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：29、32或34(表11)中任一者標識之胺基酸序列、或為由SEQ ID NO：29、32或34(表11)中任一者標識之胺基酸序列之片段、或為與由SEQ ID NO：29、32或34(表11)中任一者標識之胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0055] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為HCoV-OC43結構蛋白。例如，HCoV-OC43結構蛋白可為刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核鞘蛋白(N)、膜蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，HCoV-OC43結構蛋白為刺突蛋白(S)。在一些實施例中，HCoV-OC43結構蛋白為刺突蛋白(S)或其免疫原性片段之S1次單位或S2次單位。 |
| [0056] | 在一些實施例中，至少一種HCoV-OC43抗原性多肽包含由SEQ ID NO：30(表11)中任一者標識之胺基酸序列。在一些實施例中，HCoV-OC43抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：30(表11)中任一者標識之胺基酸序列，或為由SEQ ID NO：30(表11)中任一者標識之胺基酸序列之片段，或為與由SEQ ID NO：30(表11)中任一者標識之胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0057] | 在一些實施例中，抗原性多肽為HCoV-HKU1結構蛋白。例 如，HCoV-HKU1結構蛋白可為刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核鞘蛋白(N)、膜蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，HCoV-HKU1結構蛋白為刺突蛋白(S)。在一些實施例中，HCoV-HKU1結構蛋白為刺突蛋白(S)或其免疫原性片段之S1次單位或S2次單位。 |
| [0058] | 在一些實施例中，至少一種HCoV-HKU1抗原性多肽包含由SEQ ID NO：31(表11)中任一者標識之胺基酸序列。在一些實施例中，HCoV-HKU1抗原性多肽之胺基酸序列為由SEQ ID NO：31(表11)中任一者標識之胺基酸序列，或為由SEQ ID NO：31(表11)中任一者標識之胺基酸序列之片段，或為與由SEQ ID NO：31(表11)中任一者標識之胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物或變異體。 |
| [0059] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之開放閱讀框架經密碼子最佳化。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種具有由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列之抗原性多肽且為經密碼子最佳化之mRNA。 |
| [0060] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗進一步包含佐劑。 |
| [0061] | 表4、7、12及15提供所關注之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)入藏登記號。應瞭解，片語「表4、7、12及15之胺基酸序列」係指由表4、7、12及15中所列之一或多個NCBI入藏登記號標識之胺基酸序列。本發明之構築體(聚核苷酸/多肽)中包括表4、7、12及15之入藏登記號所涵蓋之每個胺基酸序列及與每個胺基酸序列具有大於95%之一致性或大於98%之一致性的變異體。 |
| [0062] | 在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46(表2、5、10及13；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之序列且與野生型mRNA序列具有小於80%之一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46(表2、5、10及13；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之序列且與野生型mRNA序列具有小於75%、85%或95%之一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46(表2、5、10及13；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之序列且與野生型mRNA序列具有小於50至80%、60至80%、40至80%、30至80%、70至80%、75至80%或78至80%之一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46(表2、5、10及13；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之序列且與野生型mRNA序列具有小於40至85%、50至85%、60至85%、30至85%、70至85%、75至85%或80至85%之一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46(表2、5、10及13；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之序列且與野生型mRNA序列具有小於40至90%、50至90%、60至90%、30至90%、70至90%、75至90%、80至90%或85至90%之一致性之核酸編碼。 |
| [0063] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種具有由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列且與野生型mRNA序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)之一致性之抗原性多肽，但不包括野生型 mRNA序列。 |
| [0064] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種具有由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列且與野生型mRNA序列具有小於95%、90%、85%、80%或75%之一致性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種具有由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列之抗原性多肽且與野生型mRNA序列具有30至80%、40至80%、50至80%、60至80%、70至80%、75至80%或78至80%、30至85%、40至85%、50至85%、60至85%、70至85%、75至85%或78至85%、30至90%、40至90%、50至90%、60至90%、70至90%、75至90%、80至90%或85至90%之一致性。 |
| [0065] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種與由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種與由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之抗原性多肽。 |
| [0066] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種與由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序 列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種與由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50(表3、6、11及14；亦參見表4、7、12及15之胺基酸序列)中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。 |
| [0067] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種附著至細胞受體之抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)。 |
| [0068] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種致使病毒與細胞膜融合之抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)。 |
| [0069] | 在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種負責病毒與受感染之細胞結合之抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上 述抗原性多肽之任意組合)。 |
| [0070] | 本發明之一些實施例提供一種疫苗，其包括至少一種調配於脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼至少一種抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)之開放閱讀框架、至少一個5'端帽及至少一個化學修飾。 |
| [0071] | 在一些實施例中，5’端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。 |
| [0072] | 在一些實施例中，至少一個化學修飾係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之第5位。在一些實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。 |
| [0073] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質為可電離之陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些實施例中，陽離子脂質係選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。 |
| [0074] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子包含下文論述之式(I)及/或式(II)之化合物。 |
| [0075] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在包含選自下文所述之化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112及122之化合物的脂質奈米粒子中調配。 |
| [0076] | 本發明之一些實施例提供一種疫苗，其包括至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼至少一種抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)之開放閱讀框架，其中開放閱讀框架中至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)之尿嘧啶具有化學修飾，視情況其中該疫苗在脂質奈米粒子(例如，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質)中調配。 |
| [0077] | 在一些實施例中，開放閱讀框架中100%之尿嘧啶具有化學修飾。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之第5位。在一些實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，開放閱讀框架中100%之尿嘧啶在尿嘧啶之第5位具有N1-甲基假尿苷。 |
| [0078] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之開放閱讀框架編碼至少兩種抗原性多肽(例如，至少兩種hMPV抗原性多肽、至少兩種PIV3抗原性多肽、至少兩種RSV抗原性多肽、至少兩種MeV抗原性多肽或至少兩種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上 述抗原性多肽之任意組合)。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼至少五種或至少十種抗原性多肽。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼至少100種抗原性多肽。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼2至100種抗原性多肽。 |
| [0079] | 在一些實施例中，疫苗包含至少兩種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含至少五種或至少十種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含至少100種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含2至100種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架。 |
| [0080] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)與信號肽融合。在一些實施例中，信號肽係選自：HuIgGk信號肽(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQ ID NO：15)；IgE重鏈ε-1信 號肽(MDWTWILFLVAAATRVHS；SEQ ID NO：16)；日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：17)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：18)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：19)。 |
| [0081] | 在一些實施例中，信號肽與至少一種抗原性多肽之N末端融合。在一些實施例中，信號肽與至少一種抗原性多肽之C末端融合。 |
| [0082] | 在一些實施例中，至少一種抗原性多肽(例如，至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽或至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合)包含突變N-連接之醣基化位點。 |
| [0083] | 本文亦提供一種前述段落中任一項之RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，hMPV疫苗、PIV3疫苗、RSV疫苗、MeV疫苗或βCoV疫苗，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述疫苗之任意組合)，其調配於奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)中。 |
| [0084] | 在一些實施例中，奈米粒子具有50至200nm之平均直徑。在一些實施例中，奈米粒子為脂質奈米粒子。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含以莫耳比計約20至60%之陽離子脂質、0.5-15%之經PEG改質之脂質、25至55%之固 醇及25%之非陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質為可電離之陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些實施例中，陽離子脂質係選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。 |
| [0085] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子包含如下文論述之式(I)及/或式(II)之化合物。 |
| [0086] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子包含如下文論述之化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112或122。 |
| [0087] | 在一些實施例中，奈米粒子具有小於0.4(例如，小於0.3、0.2或0.1)之多分散性值。 |
| [0088] | 在一些實施例中，奈米粒子在中性pH值下具有淨中性電荷值。 |
| [0089] | 在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗為多價的。 |
| [0090] | 本發明之一些實施例提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，其包括向個體投與可有效產生抗原特異性免疫反應之量的如本文提供之任意RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗為hMPV疫苗、PIV3疫苗、RSV疫苗、MeV疫苗或βCoV疫苗，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1疫苗。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗為包含任意兩種或兩種以上上述疫苗之組合的組合疫苗。 |
| [0091] | 在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應。 |
| [0092] | 在一些實施例中，一種產生抗原特異性免疫反應之方法包括 向個體投與單次劑量(無補強劑量)之本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗為hMPV疫苗、PIV3疫苗、RSV疫苗、MeV疫苗或βCoV疫苗，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1疫苗。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗為包含任意兩種或兩種以上上述疫苗之組合的組合疫苗。 |
| [0093] | 在一些實施例中，一種方法進一步包含向個體投與第二(補強)劑量之RNA(例如，mRNA)疫苗。可投與額外劑量之RNA(例如，mRNA)疫苗。 |
| [0094] | 在一些實施例中，個體在第一劑量或第二(補強)劑量之疫苗後展示至少80%(例如，至少85%、至少90%或至少95%)之血清轉化率。血清轉化為特異性抗體產生且在血液中變得可偵測之時間段。在發生血清轉化之後，可在用於抗體之血液測試中偵測病毒。在感染或免疫期間，抗原進入血液，且免疫系統開始作出響應而產生抗體。在血清轉化之前，抗原本身可偵測或不可偵測，但認為不存在抗體。在血清轉化期間，存在抗體，但尚不可偵測。血清轉化後之任意時間，在血液中可偵測到抗體，表明處於感染之前或正在感染。 |
| [0095] | 在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與RNA(例如，mRNA)疫苗。 |
| [0096] | 本發明之一些實施例提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，其包括向個體投與在個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量的RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，個體中之抗原特異性免疫反應可藉由在向個體投與本發明之任意RNA(例如，mRNA)疫苗後分析抗體效價(，與hMPV、PIV3、RSV、MeV 及/或βCoV抗原性多肽結合之抗體的效價)來測定。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少1 log。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了1至3 log。 |
| [0097] | 在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少2倍。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少5倍。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少10倍。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了2至10倍。 |
| [0098] | 在一些實施例中，對照物為在未投與本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。在一些實施例中，對照物為在投與了活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價(參見例如Ren J.等人，J of Gen.Virol.2015；96：1515-1520)或其中對照值為在投與了重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。在一些實施例中，對照物為在投與了hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價(參見例如Cox RG等人，J Virol.2014年6月；88(11)：6368-6379)。 |
| [0099] | 向個體投與有效量(有效誘發免疫反應之量)之本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，有效量為等同於比重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍的劑 量，其中在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗、純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗、活減毒hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗、不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗或hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV VLP疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。在一些實施例中，有效量為等同於比重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低2至1000倍的劑量，其中在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗、純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗、活減毒hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗、不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗或hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV VLP疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0100] | 在一些實施例中，對照值為在投與了包含hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV之結構蛋白之病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0101] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗以在個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量調配。 |
| [0102] | 在一些實施例中，有效量為25μg至1000μg或50μg至1000μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為100μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與25μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與100μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與400μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向該個體投與500μg之劑量。 |
| [0103] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之功效(或有效 性)大於60%。在一些實施例中，疫苗之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼至少一種hMPV抗原性多肽、至少一種PIV3抗原性多肽、至少一種RSV抗原性多肽、至少一種MeV抗原性多肽、至少一種βCoV抗原性多肽，例如選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1或兩種或兩種以上上述抗原性多肽之任意組合。 |
| [0104] | 可使用標準分析(參見例如Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)來評估疫苗功效。例如，可藉由雙盲隨機化臨牀控制試驗來量測疫苗功效。疫苗功效可表述為未經疫苗接種(ARU)與經疫苗接種(ARV)研究組之間之疾病侵襲率(AR)的成比例減小且可利用下式，由疫苗接種組之間之疾病相對風險(RR)來計算：功效=(ARU-ARV)/ARU×100；及功效=(1-RR)×100。 |
| [0105] | 同樣，可使用標準分析(參見例如Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)來評估疫苗有效性。疫苗有效性係對疫苗(其已證明具有高疫苗功效)如何減少群體疾病之評估。此量測可評估在天然場地條件下而非在受控臨牀試驗中之淨利益平衡及疫苗接種程式(不僅疫苗本身)之不利作用。疫苗有效性與疫苗功效(效能)成正比，但亦受群體中之標靶組受免疫之程度以及影響住院治療、動態訪問或成本之「現實」結果之其他非疫苗相關因素的影響。例如，可使用可追溯之病例對照分析，其中對一組受感染病例中之疫苗接種率與適當對照值進行比較。疫苗有效性可表述為比率差異，利用優勢比(OR)用於發展感染，而不管是否疫苗接種：有效性=(1-OR)×100。 |
| [0106] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之功效(或有效性)為至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。 |
| [0107] | 在一些實施例中，疫苗使個體對hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上述病毒之任意組合免疫持續長達2年。在一些實施例中，疫苗使個體對hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上述病毒之任意組合免疫持續2年以上、3年以上、4年以上或持續5至10年。 |
| [0108] | 在一些實施例中，個體為約5歲或5歲以下。例如，個體年齡可在約1歲與約5歲(例如，約1、2、3、5或5歲)之間或年齡在約6個月與約1歲(例如，約6、7、8、9、10、11或12個月)之間。在一些實施例中，個體為約12個月或12個月以下(例如，12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2個月或1個月)。在一些實施例中，個體為約6個月或6個月以下。 |
| [0109] | 在一些實施例中，個體為足月出生(例如，約37至42週)。在一些實施例中，個體為早產，例如在妊娠約36週或更早(例如，約36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25週)。例如，個體可在妊娠約32週或更早時出生。在一些實施例中，個體在妊娠約32週與約36週之間早產。在該等個體中，可在後期投與RNA(例如，mRNA)疫苗，例如在約6個月至約5歲或更大年齡時投與。 |
| [0110] | 在一些實施例中，在投與RNA(例如，mRNA)疫苗時，個體 為懷孕的(例如，處於孕早期、孕中期或孕晚期)。諸如hMPV、PIV3及RSV之病毒導致主要嬰幼兒之下呼吸道感染。三分之一之RSV相關死亡例如發生在一歲以內，其中99%之該等死亡發生在資源缺乏之國家。其在美國廣泛傳播以致幾乎所有兒童在第二個生日之前均感染此病毒。因此，本發明提供用於產婦免疫之RNA(例如，mRNA)疫苗以改良母親與幼兒之間之傳播從而防止該病毒。 |
| [0111] | 在一些實施例中，個體為年齡在約20歲與約50歲之間(例如，約20、25、30、35、40、45或50歲)之年輕人。 |
| [0112] | 在一些實施例中，個體為約60歲、約70歲或更大(例如，約60、65、70、75、80、85或90歲)之老年個體。 |
| [0113] | 在一些實施例中，個體患有慢性肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘)。兩種形式之COPD包括慢性支氣管炎，其包涵長期咳嗽伴有黏液，及肺氣腫，其久而久之會對肺造成損傷。因此，投與了RNA(例如，mRNA)疫苗之個體可患有慢性支氣管炎或肺氣腫。 |
| [0114] | 在一些實施例中，個體已暴露於hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上述病毒之任意組合；個體感染hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上述病毒之任意組合；或個體存在受hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)或兩種或兩種以上上 述病毒之任意組合感染之風險。 |
| [0115] | 在一些實施例中，個體免疫功能不足(具有受損之免疫系統，例如患有免疫病症或自體免疫病症)。 |
| [0116] | 在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗經化學修飾。在其他實施例中，核酸疫苗未經修飾。 |
| [0117] | 又，其他態樣提供用於對個體進行疫苗接種之組合物及方法，其包括向個體投與包含一或多種具有編碼第一呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且其中佐劑不與疫苗共同調配或共同投藥。 |
| [0118] | 在其他態樣中，本發明為一種用於對個體進行疫苗接種之組合物及方法，其包括向個體投與包含一或多種具有編碼第一抗原性呼吸道病毒多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，其中向個體投與10ug/kg與400ug/kg之間劑量之核酸疫苗。在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與核酸疫苗。在一些實施例中，在第0天向個體投與核酸疫苗。在一些實施例中，在第21天向個體投與第二劑量之核酸疫苗。 |
| [0119] | 在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括25微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括100微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括50微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括75微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括150微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括400微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，向個體投與之核酸疫苗中包括200微克劑量之RNA聚核苷酸。在一些實施例 中，RNA聚核苷酸在局部淋巴結中比在遠端淋巴結中以高出100倍之水準積聚。在其他實施例中，核酸疫苗經化學修飾且在其他實施例中，核酸疫苗未經化學修飾。 |
| [0120] | 本發明之態樣提供一種核酸疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，其中該疫苗中不包括佐劑。在一些實施例中，穩定元件為組蛋白莖環。在一些實施例中，穩定元件為相對於野生型序列而言GC含量減少之核酸序列。 |
| [0121] | 本發明之態樣提供包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，其中調配物中存在RNA聚核苷酸以供活體內投與宿主，其為可接受百分比之人類個體賦予優於第一抗原之血清保護標準之抗體效價。在一些實施例中，抗體效價為中和抗體效價。 |
| [0122] | 亦提供包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，其中調配物中存在RNA聚核苷酸以供活體內投與宿主，以便引發比具有穩定元件或與佐劑一起調配且編碼第一抗原性多肽之mRNA疫苗引發之抗體效價更持久之高抗體效價。在一些實施例中，調配RNA聚核苷酸以在單次投藥一週內產生中和抗體。在一些實施例中，佐劑選自陽離子肽及免疫刺激核酸。在一些實施例中，陽離子肽為魚精蛋白。 |
| [0123] | 態樣提供包含一或多種具有包含至少一個化學修飾或視情況無化學修飾之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中調配物中存在RNA聚核苷酸以供活體內投與宿主，以便宿主中之抗原表現水準顯著超過由具有穩定元件或與佐劑一起調配且編碼第一抗原性多肽之mRNA疫 苗所產生之抗原表現水準。 |
| [0124] | 其他態樣提供包含一或多種具有包含至少一個化學修飾或視情況無化學修飾之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗具有比未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需至少少10倍之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，存在25至100微克劑量之RNA聚核苷酸。 |
| [0125] | 本發明之態樣亦提供一使用單位之疫苗，其包含10ug與400ug之間之一或多種具有包含至少一個化學修飾或視情況無化學修飾之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，且包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，其經調配用於傳遞至人類個體。在一些實施例中，疫苗進一步包含陽離子脂質奈米粒子。 |
| [0126] | 本發明之態樣提供在個體或個體群體中產生、維持或恢復對呼吸道病毒菌株之抗原性記憶的方法，其包括對該個體或群體投與抗原性記憶補強核酸疫苗，該疫苗包含(a)至少一種RNA聚核苷酸，該聚核苷酸包含至少一個化學修飾或視情況無化學修飾及兩個或兩個以上密碼子最佳化開放閱讀框架，該等開放閱讀框架編碼一組參考抗原性多肽，及(b)視情況醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，經由選自由肌肉內投藥、皮內投藥及皮下投藥組成之群之途徑向個體投與疫苗。在一些實施例中，投藥步驟包括使個體之肌肉組織與適合注射組合物之裝置接觸。在一些實施例中，投藥步驟包括使個體之肌肉組織與適合注射組合物之裝置接觸，並與電穿孔組合。 |
| [0127] | 本發明之態樣提供對個體進行疫苗接種之方法，其包括向個體投與使個體有效疫苗接種之量的25ug/kg與400ug/kg之間單次劑量之核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多種具有編碼第一抗原性 多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸。 |
| [0128] | 其他態樣提供包含一或多種具有包含至少一個化學修飾之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗具有比未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需至少少10倍之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，存在25至100微克劑量之RNA聚核苷酸。 |
| [0129] | 其他態樣提供包含經LNP調配之具有不包含化學修飾(未經修飾)之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的核酸疫苗，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗具有比未在LNP中調配之未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需至少少10倍之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，存在25至100微克劑量之RNA聚核苷酸。 |
| [0130] | 實例中提供之資料表明使用本發明之調配物顯著增強之免疫反應。資料表明本發明之經化學修飾及未經修飾RNA疫苗之有效性。令人驚訝地，與先前技術報導較佳使用在載劑中調配之未經化學修飾之mRNA來生產疫苗相反，本文中發現經化學修飾之mRNA-LNP疫苗比未經修飾之mRNA需要低得多之有效性mRNA劑量，亦即當在除LNP以外之載劑中調配時比未經修飾之mRNA少十倍。本發明之經化學修飾及未經修飾之RNA疫苗比在不同脂質載劑中調配之mRNA疫苗產生更佳之免疫反應。 |
| [0131] | 在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療60歲或60歲以上老年個體之方法，其包括向個體投與對個體有效疫苗接種之量的包含一或多種具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸之核酸疫苗。 |
| [0132] | 在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療17歲或17歲以下年輕個體之方法，其包括向個體投與對個體有效疫苗接種之量的包含一 或多種具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸之核酸疫苗。 |
| [0133] | 在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療成年個體之方法，其包括向個體投與對個體有效疫苗接種之量的包含一或多種具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸之核酸疫苗。 |
| [0134] | 在一些態樣中，本發明為一種以包括至少兩個編碼呼吸道抗原之核酸序列的組合疫苗對個體進行疫苗接種之方法，其中該疫苗之劑量為組合治療劑量，其中每種編碼抗原之個別核酸的劑量為次治療劑量。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中25微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中100微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中50微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中75微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中150微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，組合劑量為在投與個體之核酸疫苗中400微克之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，每種編碼抗原之個別核酸之次治療劑量為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微克。在其他實施例中，核酸疫苗經化學修飾，且在其他實施例中，核酸疫苗未經化學修飾。 |
| [0135] | RNA聚核苷酸為SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23、35至46、57至61及64至80之一且包括至少一個化學修飾。在其他實施例中，RNA聚核苷酸為SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23、35至46、57至61及64至80之一且不包括任何化學修飾或未經修飾。又在其他實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼SEQ ID NO：5至 8、12至13、24至34及47至50中任一者之抗原性蛋白且包括至少一個化學修飾。在其他實施例中，RNA聚核苷酸編碼SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34及47至50中任一者之抗原性蛋白且不包括任何化學修飾或未經修飾。 |
| [0136] | 下文[實施方式]中描述本發明之各種實施例之詳情。本發明之其他特徵、目標及優勢將由[實施方式]及[申請專利範圍]顯而易見。 |
| 【實施方式】 | |
| [0159] | 在一些實施例中，本發明提供包含RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之疫苗，該等聚核苷酸編碼人類偏肺病毒(hMPV)抗原性多肽、第3型副流行性感冒病毒(PIV3)抗原性多肽、呼吸道融合病毒(RSV)抗原性多肽、麻疹病毒(MeV)抗原性多肽或β冠狀病毒抗原性多肽(例如，中東呼吸道徵候群冠狀病毒(MERS-CoV)、SARS-CoV、人類冠狀病毒(HCoV)-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH(紐哈芬)及HCoV-HKU1)(參見例如Esper F.等人，Emerging Infectious Diseases,12(5),2006；及Pyrc K.等人，Journal of Virology,81(7)：3051-57,2007，其各自之內容以其全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，本發明亦提供包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之組合疫苗，該聚核苷酸編碼至少兩種選自hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽之抗原性多肽。本文亦提供投與RNA(例如，mRNA)疫苗之方法、產生RNA(例如，mRNA)疫苗之方法、包含RNA(例如，mRNA)疫苗之組合物(例如，醫藥組合物)及編碼RNA(例如，mRNA)疫苗之核酸(例如， DNA)。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包含佐劑，諸如本文提供之鞭毛蛋白佐劑。 |
| [0160] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，hMPV、PIV3、RSV、MeV、βCoV RNA疫苗及其組合)可用於誘發平衡免疫反應，包含細胞及體液免疫性，而無與DNA疫苗接種相關之多種風險。 |
| [0161] | 國際申請案第PCT/US2015/02740號之整個內容以引用之方式併入本文中。 |
| [0162] | 人類偏肺病毒(hMPV) |
| [0163] | hMPV與其表面醣蛋白中之呼吸道融合病毒(RSV)共有實質同源性。hMPV融合蛋白(F)與其他副黏液病毒融合蛋白相關且似乎具有可具有類似功能之同源區。hMPV融合蛋白胺基酸序列含有具有其他副黏液病毒F蛋白特徵之特徵，包括推定裂解位點及潛在N連接醣基化位點。副黏液病毒融合蛋白經合成為不活化前驅體(F0)，其由宿主細胞蛋白酶裂解為生物融合-活性F1及F2結構域(參見例如Cseke G.等人，Journal of Virology 2007；81(2)：698-707，其以引用之方式併入本文中)。hMPV具有一個推定裂解位點，與關於RSV F確定之兩個位點形成對比，且僅與RSV F共有34%之胺基酸序列一致性。F2為細胞外且經二硫化物連接至F1。融合蛋白為以三聚體形式存在之I型醣蛋白，在蛋白之N-及C末端區具有兩個4-3七肽重複結構域(HR1及HR2)，其形成捲曲螺旋α-螺旋。當蛋白經歷構形變化為促融狀態時，該等捲曲螺旋以反平行之方式並置。在N末端七肽重複之近端存在疏水性融合肽N，其認為係插入標靶細胞膜中，而七肽重複之締合使得跨膜結構域密切接近，誘發膜融合(參見例如Baker,KA等人Mol.Cell 1999；3：309-319)。已為多種不同病毒推薦此機制，包括RSV、流 感病毒及人類免疫缺乏病毒。融合蛋白為用於所有已知副黏液病毒及具備類似融合蛋白之其他病毒(諸如人類免疫缺乏病毒、流感病毒及埃博拉病毒(Ebola virus))之主要抗原性決定子。 |
| [0164] | 在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV融合蛋白(F)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV F蛋白之F1或F2次單位的RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV醣蛋白(G)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV基質蛋白(M)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV磷蛋白(P)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV核蛋白(N)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼hMPV SH蛋白(SH)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0165] | 在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白及SH蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0166] | 在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白及G蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白及SH蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0167] | 在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼G蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼G蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼G蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼G蛋白及SH蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0168] | 在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之hMPV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及SH蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0169] | hMPV疫苗可包含例如至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種由SEQ ID NO：5至8(表3；亦參見表4之胺基酸序列)中任一者標識之hMPV抗原性多肽之開放閱讀框架。 |
| [0170] | hMPV疫苗可包含例如至少一種由SEQ ID NO：1至4(表2)中任一者標識之核酸(例如，DNA)編碼之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0171] | 本發明不受hMPV之特定菌株限制。用於疫苗中之hMPV菌株可為hMPV之任何菌株。如本文提供使用之hMPV菌株之非限制性實例包括CAN98-75(CAN75)及CAN97-83(CAN83)hMPV菌株(Skiadopoulos MH等人J Virol.20014；78(I3)6927-37，其以引用之方式併入本文中)、hMPV A1、A2、B1或B2菌株(參見例如de Graaf M等人The Journal of General Virology 2008；89：975-83； Peret TCT等人The Journal of Infectious Disease 2002；185：1660-63，其以引用之方式併入本文中)、hMPV分離株TN/92-4(例如，SEQ ID NO：1及5)、hMPV分離株NL/1/99(例如，SEQ ID NO：2及6)或hMPV分離株PER/CFI0497/2010/B(例如，SEQ ID NO：3及7)。 |
| [0172] | 在一些實施例中，至少一種hMPV抗原性多肽由hMPV A1、A2、B1或B2菌株獲得(參見例如de Graaf M等人The Journal of General Virology 2008；89：975-83；Peret TCT等人The Journal of Infectious Disease 2002；185：1660-63，其以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由CAN98-75(CAN75)hMPV菌株獲得。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由CAN97-83(CAN83)hMPV菌株獲得。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由hMPV分離株TN/92-4(例如，SEQ ID NO：1及5)獲得。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由hMPV分離株NL/1/99(例如，SEQ ID NO：2及6)獲得。在一些實施例中，至少一種抗原性多肽由hMPV分離株PER/CFI0497/2010/B(例如，SEQ ID NO：3及7)獲得。 |
| [0173] | 在一些實施例中，hMPV疫苗包含編碼與hMPV F蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有F蛋白活性之hMPV抗原性多肽的RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0174] | 例如，若蛋白用於融合病毒包膜及宿主細胞漿膜、介導病毒經由與精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸RGD-結合整合素相互作用進入宿主細胞、或其組合，則認為該蛋白具有F蛋白活性(參見例如Cox RG等人J Virol.2012；88(22)：12148-60，其以引用之方式併入本文中)。 |
| [0175] | 在一些實施例中，hMPV疫苗包含編碼與hMPV G蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有G蛋白活性之hMPV抗原性多肽的RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0176] | 例如，若蛋白用於調節(例如，抑制)hMPV誘發之細胞(免疫)反應，則認為該蛋白具有G蛋白活性(參見例如Bao X等人PLoS Pathog.2008；4(5)：e1000077，其以引用之方式併入本文中)。 |
| [0177] | 人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3) |
| [0178] | 副流行性感冒病毒屬於副黏液病毒科。該等病毒為具有負義單股RNA基因體之包膜病毒。副流行性感冒病毒屬於副黏液病毒亞科，其再分為三個屬：呼吸道病毒屬(PIV-1、PIV-3及仙台病毒(Sendai virus，SeV))、腮腺炎病毒屬(PIV-2、PIV-4及流行性腮腺炎病毒)及麻疹病毒屬(麻疹病毒、牛瘟病毒及犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV))。其基因體(一種約15 500個核苷酸長之負義RNA分子)編碼兩種包膜醣蛋白、血球凝集素-神經胺糖酸酶(HN)、融合蛋白(F或F0)(其裂解為F1及F2次單位)、基質蛋白(M)、核鞘蛋白(N)及包括病毒複製酶(L)之若干種非結構蛋白。除PIV-1以外，所有副流行性感冒病毒均表現在受感染之細胞中阻斷IFN信號轉導且因此充當毒力因子之非結構V蛋白(參見例如Nishio M等人J Virol.2008；82(13)：6130-38)。 |
| [0179] | 在病毒包膜上發現PIV3血球凝集素-神經胺糖酸酶(HN)(一種結構蛋白)，其在此處對於附著及細胞進入而言為必要的。其識別且結合宿主細胞表面上之含唾液酸受體。作為一種神經胺糖酸酶，HN自病毒粒子移除唾液酸，防止病毒自凝集且促進病毒之有效傳播。此外，HN促進融合(F或F0)蛋白之活性，導致宿主細胞表面之滲透。 |
| [0180] | PIV3融合蛋白(PIV3 F)位於病毒包膜上，其在此處促使病毒融合及細胞進入。F蛋白初始為不活化的，但蛋白水解裂解導致其活性形式F1及F2，其由雙硫鍵連接。當HN蛋白在宿主細胞表面上結合其受體時，發生此情形。在感染早期，F醣蛋白藉由使病毒包膜與漿膜融合來介導宿主細胞滲透。在感染後期，F蛋白促使感染細胞與相鄰之未感染細胞融合，此導致形成融合細胞及感染傳播。 |
| [0181] | PIV3基質蛋白(M)在病毒包膜內發現且有助於病毒組裝。其與核鞘及包膜醣蛋白相互作用，此時其促使後代病毒經由與病毒醣蛋白及核鞘之細胞質尾上之特異性位點相互作用而萌芽。其在將病毒組分傳輸至萌芽位點中亦發揮作用。 |
| [0182] | 在核鞘中發現PIV3磷蛋白(P)及PIV3大聚合酶蛋白(L)，其在此處形成RNA聚合酶複合物之部分。L蛋白(一種病毒RNA依賴性RNA聚合酶)促使基因體轉錄，而宿主細胞之核糖體將病毒mRNA轉譯為病毒蛋白。 |
| [0183] | PIV3 V為在受感染之細胞中阻斷IFN信號轉導，因此充當毒力因子之非結構蛋白。 |
| [0184] | PIV3核蛋白(N)以每6個核糖核苷酸1N之比率使基因體殼體化，對其進行保護以防核酸酶。核鞘(NC)具有螺旋形結構。殼體化之基因體RNA稱為NC且用作轉錄及複製之模板。在複製期間，由PIV3 N殼體化與RNA合成偶合且所有複製產物均對核酸酶具有抗性。PIV3 N高-多聚化以形成核鞘且結合至病毒基因體RNA。PIV3 N結合P蛋白且藉此將聚合酶定位於模板上。 |
| [0185] | 在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3融合蛋白(F)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3 F蛋白之F1或F2次單位之RNA(例如， mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3血球凝集素-神經胺糖酸酶(HN)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸(參見例如van Wyke Coelingh KL等人J Virol.1987；61(5)：1473-77，其以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3基質蛋白(M)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3磷蛋白(P)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼PIV3核蛋白(N)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0186] | 在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0187] | 在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白及HN蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0188] | 在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼HN蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼HN蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼HN蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0189] | 在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白、HN蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白、HN蛋白及P蛋白之RNA(例 如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之PIV3疫苗包含編碼F蛋白、HN蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0190] | PIV3疫苗可包含例如至少一種具有編碼至少一種由SEQ ID NO：12至13(表6；亦參見表7之胺基酸序列)中任一者標識之PIV3抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0191] | PIV3疫苗可包含例如至少一種由SEQ ID NO：9至12(表5；亦參見表7之核酸序列)中任一者標識之核酸(例如，DNA)編碼之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0192] | 本發明不受PIV3之特定菌株限制。用於疫苗中之PIV3菌株可為PIV3之任何菌株。如本文提供使用之PIV3菌株之非限制性實例包括HPIV3/智人/PER/FLA4815/2008。 |
| [0193] | 在一些實施例中，PIV3疫苗包含編碼與PIV3 F蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有F蛋白活性之PIV3抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0194] | 在一些實施例中，PIV3疫苗包含編碼與PIV3血球凝集素-神經胺糖酸酶(HN)具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有血球凝集素-神經胺糖酸酶活性之PIV3抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0195] | 例如，若蛋白能夠受體結合及受體裂解，則認為該蛋白具有血球凝集素-神經胺糖酸酶活性。該等蛋白為具有用於細胞附著及神經胺糖酸酶活性之功能位點之主要表面醣蛋白。其能夠致使紅血球凝聚且裂解神經胺糖酸之糖苷鍵聯，因此其具有結合潛在宿主細胞且隨後若必要釋放細胞例如用以防止病毒自凝集之潛能。 |
| [0196] | 在一些實施例中，PIV3疫苗包含編碼與PIV3 HN、F(例如，F、F1或F2)、M、N、L或V具有至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%或至少99%之一致性且分別具有HN、F(例如，F、F1或F2)、M、N、L或V活性之PIV3抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0197] | 呼吸道融合病毒(RSV) |
| [0198] | RSV為肺病毒亞科屬之負義、單股RNA病毒。該病毒存在至少兩種抗原性亞群，稱為A群與B群，主要源於表面G醣蛋白之差異。兩種RSV表面醣蛋白-G及F-介導與呼吸道上皮細胞附著且介導附著至呼吸道上皮細胞。F表面醣蛋白介導相鄰細胞之聚結。此導致形成細胞融合性細胞。RSV為支氣管炎之最常見原因。大多數受感染之成年人發生輕度類似感冒之症狀，諸如充血、低熱及喘息。嬰兒及小孩可能遭受更嚴重之症狀，諸如支氣管炎及肺炎。該疾病可經由與呼吸道分泌物接觸而在人類間傳播。 |
| [0199] | RSV之基因體編碼至少三種表面醣蛋白(包括F、G及SH)、四種核鞘蛋白(包括L、P、N及M2)及一種基質蛋白M。醣蛋白F藉由病毒粒子與宿主膜之間之融合引導病毒滲透。醣蛋白G為H型跨膜醣蛋白且為主要附著蛋白。SH為短整合膜蛋白。基質蛋白M發現於脂質雙層之內層中且輔助病毒粒子形成。核鞘蛋白L、P、N及M2調節RSV基因體之複製及轉錄。認為醣蛋白G連接且穩定支氣管上皮細胞表面之病毒粒子，而醣蛋白F與細胞糖胺聚多糖相互作用來介導RSV病毒粒子內容物融合且傳遞至宿主細胞中(Krzyzaniak MA等人PLoS Pathog 2013；9(4))。 |
| [0200] | 在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼L蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼P蛋白之 RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼M2蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0201] | 在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0202] | 在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及G蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及L蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及M2蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0203] | 在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白及L蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白及M2蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼G蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0204] | 在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及L蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及M2蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗包含編碼F蛋白、G蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0205] | 本發明本發明不受RSV之特定菌株限制。用於疫苗中之RSV菌株可為RSV之任何菌株。 |
| [0206] | 在一些實施例中，RSV疫苗包含編碼與RSV F蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有F蛋白活性之RSV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0207] | 在一些實施例中，RSV疫苗包含編碼與RSV G蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有G蛋白活性之RSV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0208] | 例如，若蛋白用於調節(例如，抑制)hMPV誘發之細胞(免疫)反應，則認為該蛋白具有G蛋白活性(參見例如Bao X等人PLoS Pathog.2008；4(5)：e1000077，其以引用之方式併入本文中)。 |
| [0209] | 麻疹病毒(MeV) |
| [0210] | 分子流行病學研究及病毒學監測尤其有助於控制及預防麻疹。世界範圍內接近一半之麻疹相關死亡發生在印度，但該國家許多地區之病毒學監測資料尚不完整。先前研究已記載在印度存在麻疹病毒基因型D4、D7及D8，且在相鄰國家已偵測到基因型D5、D9、D11、H1及G3。最近，在印度偵測到MeV基因型B3 (Kuttiatt VS等人Emerg Infect Dis.2014；20(10)：1764-66)。 |
| [0211] | 副黏液病毒之醣蛋白複合物介導受體結合及膜融合。特定而言，MeV融合(F)蛋白在由血球凝集素(HA)蛋白進行受體結合後執行膜融合(Muhlebach MD等人Journal of Virology 2008；82(22)：11437-45)。MeV P基因編碼三種蛋白：P，一種必需聚合酶輔因子，與V及C，其具有多種功能，但並非病毒之培養細胞中繁殖所嚴格需要。V與P共有胺基末端結構域但具有鋅結合羧基末端結構域，而C由重疊閱讀框架轉譯。MeV C蛋白為感染因子。在複製期間，P蛋白以其胺基末端結構域結合進入之單體核鞘(N)蛋白且使其定位以組裝至初生核糖核鞘中。P蛋白胺基末端結構域天然未摺疊(Deveaux P等人Journal of Virology 2004；78(21)：11632-40)。 |
| [0212] | 在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼F蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼V蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼C蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0213] | 在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白及C蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0214] | 在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白及F蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白及V蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之 MeV疫苗包含編碼HA蛋白及C蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0215] | 在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼F蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼F蛋白及V蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼F蛋白及C蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0216] | 在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白、F蛋白及P蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白、F蛋白及V蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MeV疫苗包含編碼HA蛋白、F蛋白及C蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0217] | 在一些實施例中，MeV疫苗包含編碼與MeV HA蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有MeV HA蛋白活性之MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)。 |
| [0218] | 在一些實施例中，MeV疫苗包含編碼與MeV F蛋白具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性且具有MeV F蛋白活性之MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)。 |
| [0219] | 若蛋白介導受體結合及/或膜融合，則認為該蛋白具有HA蛋白活性。MeV F蛋白在由MeV HA蛋白進行受體結合後執行膜融合。 |
| [0220] | MeV疫苗可包含例如至少一種具有編碼至少一種由SEQ ID NO：47至50(表14；亦參見表15之胺基酸序列)中任一者標識之MeV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0221] | MeV疫苗可包含例如至少一種由SEQ ID NO：37、40、43、 46(表13)中任一者標識之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0222] | MeV疫苗可包含例如至少一種由SEQ ID NO：35、36、38、39、41、42、44及45(表13)中任一者標識之核酸(例如，DNA)編碼之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0223] | 本發明不受MeV之特定菌株限制。用於疫苗中之MeV菌株可為MeV之任何菌株。如本文提供使用之MeV菌株之非限制性實例包括B3/B3.1、C2、D4、D6、D7、D8、G3、H1、Moraten、Rubeovax、MVi/紐澤西.美國/45.05、MVi/德克薩斯.美國/4.07、AIK-C、MVi/紐約.美國/26.09/3、MVi/加利福尼亞.美國/16.03、MVi/弗吉尼亞.美國/15.09、MVi/加利福尼亞.美國/8.04及MVi/賓夕法尼亞.美國/20.09。 |
| [0224] | MeV蛋白可來自MeV基因型D4、D5、D7、D8、D9、D11、H1、G3或B3。在一些實施例中，MeV HA蛋白或MeV F蛋白來自MeV基因型D8。在一些實施例中，MeV HA蛋白或MeV F蛋白來自MeV基因型B3。 |
| [0225] | β冠狀病毒(βCoV) |
| [0226] | MERS-CoV。MERS-CoV為β冠狀病毒屬之正義單股RNA病毒。基因體在系統發生學上分為兩個分支，A分支與B分支。其對無纖毛支氣管上皮細胞具有強趨向性、避開固有之免疫反應且拮抗在受感染之細胞中產生干擾素(IFN)。二肽基肽酶4(DDP4，亦稱為CD26)已確認為MERS-CoV之功能性細胞受體。感染無需其酶促活性，但其胺基酸序列在物種之間高度保守且在人類支氣管上皮及腎臟中表現。大多數感染個體發展成嚴重之急性呼吸道疾病，包括發燒、咳嗽及呼吸短促，且病毒可為致命的。該疾病可在人類中傳播，通常在緊密接觸之人類中傳播。 |
| [0227] | MERS-CoV之基因體編碼至少四種獨特之輔助蛋白(諸如3、 4a、4b及5)、兩種複製酶蛋白(開放閱讀框架1a及1b)及四種主要結構蛋白(包括刺突(S)、包膜(E)、核鞘(N)及膜(M)蛋白)(Almazan F等人MBio 2013；4(5)：e00650至13)。輔助蛋白在MERS-CoV複製中具有非必需之作用，但其可能為結構蛋白或干擾素拮抗劑，調節活體內複製效率及/或發病機理，如同SARS-CoV之情形(Almazan F等人MBio 2013；4(5)：e00650-13；Totura AL等人Curr Opin Virol 2012；2(3)：264-75；ScobeyT等人Proc Natl Acad Sci USA 2013；110(40)：16157-62)。MERS-CoV之其他蛋白在病毒複製中維持不同功能。例如，毒力中涉及E蛋白，且刪除E編碼基因產生複製勝任及傳播缺乏性病毒或減毒病毒(Almazan F等人MBio 2013；4(5)：e00650至13)。S蛋白對於經由S1次單位中之受體-結合域(RBD)介導病毒結合至表現受體二肽基肽酶-4(DPP4)尤其必要，而S2次單位隨後經由病毒與標靶細胞膜之融合介導病毒進入(Li F.J Virol 2015；89(4)：1954-64；Raj VS等人Nature 2013；495(7440)：251-4)。 |
| [0228] | 在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白之S1次單位之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白之S2次單位之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼E蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0229] | 在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白 (S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0230] | 在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及E蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0231] | 在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、M蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之MERS-CoV疫苗包含編碼E蛋白、M蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0232] | MERS-CoV疫苗可包含例如至少一種具有編碼至少一種由SEQ ID NO：24至38或33(表11；亦參見表12之胺基酸序列)中任一者標識之MERS-CoV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0233] | MERS-CoV疫苗可包含例如至少一種由SEQ ID NO：20至23(表10)中任一者標識之核酸(例如，DNA)編碼之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0234] | 本發明不受MERS-CoV之特定菌株限制。用於疫苗中之MERS-CoV菌株可為MERS-CoV之任何菌株。如本文提供使用之MERS-CoV菌株之非限制性實例包括利雅得_14_2013及 2cEMC/2012、Hasa_1_2013。 |
| [0235] | SARS-CoV。SARS-CoV之基因體包括約29,700個核苷酸長之單一正股RNA。SARS-CoV之整體基因體組織與其他冠狀病毒之整體基因體組織類似。參考基因體包括13個基因，其編碼至少14種蛋白。兩種大的重疊閱讀框架(ORF)佔基因體之71%。剩餘為12個潛在之ORF，包括結構蛋白S(刺突)、E(小包膜)、M(膜)及N(核鞘)之基因。其他潛在之ORF編碼缺少與已知蛋白類似之明顯序列的獨特推定SARS-CoV特異性多肽。關於SARS-CoV基因體之詳細分析已在J Mol Biol 2003；331：991-1004中公開。 |
| [0236] | 在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0237] | 在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及E蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0238] | 在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白及M蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼S蛋白(S、S1及/或S2)、M蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，本發明之SARS-CoV疫苗包含編碼E蛋白、M蛋白及N蛋白之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0239] | SARS-CoV疫苗可包含例如至少一種具有編碼至少一種由SEQ ID NO：29、32或34(表11；亦參見表12之胺基酸序列)中任一者標識之SARS-CoV抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0240] | 本發明不受SARS-CoV之特定菌株限制。用於疫苗中之SARS-CoV菌株可為SARS-CoV之任何菌株。 |
| [0241] | HCoV-OC43。人類冠狀病毒OC43為β冠狀病毒-1物種中之包膜、正義單股RNA病毒(β冠狀病毒屬、冠狀病毒亞科(Coronavirinae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、網巢病毒目(Nidovirales))。已由最可能自重組產生之基因型D來標識四種HCoV-OC43基因型(A至D)。兩種基因型C及D菌株之完整基因體測序及重排分析展示在產生基因型D時基因型B與C之間之重組事件。在標識之29種菌株中，均不屬於更古老之基因型A。連同HCoV-229E(甲型冠狀病毒屬中之一種物種)一起，HCoV-OC43為導致普通感冒之已知病毒。兩種病毒均可導致嚴重之下呼吸道感染，包括嬰兒、老年人及免疫功能不足個體(諸如經歷化療之彼等個體及患有HIV-AIDS之彼等個體)中之肺炎。 |
| [0242] | HCoV-HKU1。人類冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)為具有HE基因(其將病毒區分為第2組)之正義單股RNA病毒，或為β冠狀病毒。其係在2005年1月在香港之兩位患者中發現的。HCoV-HKU1之基因體為29,926個核苷酸之聚腺苷酸化RNA。GC含量為32%，在所有已知冠狀病毒中為最低。基因體組織與其他II組冠狀病毒之基因體組織相同，其特徵性基因次序為1a、1b、HE、S、E、M及N。此外，在S與E基因之間存在輔助蛋白基因(ORF4)且在N基因之位置處存在輔助蛋白基因(ORF8)。推定TRS位於AAUCUAAAC序列內，其位於每個ORF之前(除E以外)。如同在 唾淚腺炎病毒及小鼠肝炎病毒(MHV)中，E蛋白之轉譯可能經由內部核糖體進入位點而發生。3'非轉譯區含有緊接N ORF下游(核苷酸位置29647至29711)之預測莖-環結構。進一步下游，在核苷酸位置29708至29760處存在假結結構。兩種RNA結構在II組冠狀病毒中均為保守的且對於病毒複製而言係重要的。 |
| [0243] | HCoV-NL63。人類冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)之RNA基因體為27,553個核苷酸，具有poly(A)尾(圖1)。GC含量為34%，HCoV-NL63具有冠狀病毒之最低GC含量之一，其GC含量在32至42%之範圍內。在5'及3'末端分別存在286及287個核苷酸之非轉譯區。在HCoV-NL63基因體之3'部分中發現預測編碼S、E、M及N蛋白之基因。在一些II組冠狀病毒中存在之HE基因不存在，且僅有單一之單順反子輔助蛋白ORF(ORF3)位於S與E基因之間。對於所有ORF(S、ORF3、E、M及N)而言產生次基因體mRNA及HCoV-NL63之TRS之核序列定義為AACUAAA。此序列位於每個ORF之上游(除E ORF以外)，其含有次最佳之核序列AACUAUA。有趣的是，與前導序列具有完美同源性之13-核苷酸序列位於次最佳之E TRS上游。此13-核苷酸序列與前導序列黏接可充當受干擾之前導-TRS/本體-TRS相互作用之補償機制。 |
| [0244] | HCoV-229E。人類冠狀病毒229E(HCoV-229E)為網巢病毒目冠狀病毒科冠狀病毒亞科甲型冠狀病毒屬中之一種單股正義RNA病毒物種。連同人類冠狀病毒OC43一起，其致使發生普通感冒。HCoV-NL63及HCoV-229E為在世界範圍內傳播之四種人類冠狀病毒中的兩種。該兩種病毒彼此之關係獨特。在系統發生學上而言，該等病毒相比於任何其他人類冠狀病毒而言彼此更密切相關，但其僅共有65%之序列一致性。此外，該等病毒使用不同之受體進入其標靶細胞。HCoV-NL63與兒童哮吼相關，而所有徵象 表明該病毒可能導致健康成人之普通感冒。HCoV-229E為一種在健康成人中得到證明之普通感冒病毒，因此可能兩種病毒在成人中誘發相當之症狀，但其感染模式不同(Dijkman R.等人，J Formos Med Assoc.2009年4月；108(4)：270-9，其內容全文以引用之方式併入本文中)。 |
| [0245] | 組合疫苗 |
| [0246] | 本發明之實施例亦提供組合RNA(例如，mRNA)疫苗。本發明之「組合RNA(例如，mRNA)疫苗」係指一種包含至少一種(例如，至少2種、3種、4種或5種)RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之疫苗，該聚核苷酸具有編碼選自hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之任意兩種或兩種以上(或所有)抗原性多肽之組合的開放閱讀框架。 |
| [0247] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0248] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽及PIV3抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0249] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽及RSV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0250] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼 hMPV抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0251] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0252] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽及RSV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0253] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0254] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0255] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼RSV抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0256] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼RSV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0257] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0258] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0259] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0260] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0261] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0262] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0263] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽及RSV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0264] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0265] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、PIV3抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0266] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、RSV抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0267] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、RSV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0268] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼hMPV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0269] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽及MeV抗原性多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0270] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼PIV3抗原性多肽、RSV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選 自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0271] | 在一些實施例中，組合RNA(例如，mRNA)疫苗包含編碼RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽及βCoV抗原性多肽(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0272] | 本發明涵蓋其他組合呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗。 |
| [0273] | 已發現，本文所述之mRNA疫苗在若干方面優於目前之疫苗。首先，脂質奈米粒子(LNP)傳遞優於包括文獻中所述魚精蛋白基本方法之其他調配物且不必要額外佐劑。使用LNP使得可有效傳遞經化學修飾或未經修飾之mRNA疫苗。另外，本文中已證實經修飾及未經修飾之LNP調配mRNA疫苗顯著程度上優於習知之疫苗。在一些實施例中，本發明之mRNA疫苗優於習知疫苗至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍。 |
| [0274] | 儘管已試圖生產功能性RNA疫苗，包括mRNA疫苗及自複製RNA疫苗，但該等RNA疫苗之治療性功效尚未完全確定。相當驚訝的是，本發明者根據本發明之態樣已發現一類用於活體內傳遞mRNA疫苗之調配物，其導致顯著增強，且在許多方面協同之免疫反應，包括增強產生抗原及產生具有中和能力之功能性抗體。甚至當與在其他種類之基於脂質之調配物中使用之mRNA劑量相比投與顯著較低劑量之mRNA時，仍可獲得該等結果。本發明之調配物已證實足以確定功能性mRNA疫苗作為預防劑及治療劑之功效的顯著出乎意料之活體內免疫反應。另外，自複製RNA疫苗依賴於病毒複製途徑來向細胞傳遞足夠之RNA，從而產生免疫原 性反應。本發明之調配物不需要病毒複製即可產生足夠蛋白以導致強免疫反應。因此，本發明之mRNA並非自複製RNA且不包括病毒複製所必要之組分。 |
| [0275] | 在一些態樣中，本發明涵蓋驚人發現，即脂質奈米粒子(LNP)調配物顯著增強mRNA疫苗(包括經化學修飾及未經修飾之mRNA疫苗)之有效性。使用若干種不同抗原來活體內檢查中LNP中調配之mRNA疫苗的功效。本文提供之結果證實在LNP中調配之mRNA疫苗優於其他市售疫苗之出乎意料的優越功效。 |
| [0276] | 除了提供增強之免疫反應以外，本發明之調配物在比其他測試疫苗更低之抗原劑量下產生更快速之免疫反應。本發明之mRNA-LNP調配物亦比在不同載劑中調配之疫苗產生在量與質方面均更佳之免疫反應。 |
| [0277] | 本文所述之資料證實，本發明之調配物比現有之抗原疫苗產生顯著出乎意料之改良。另外，即使當mRNA之劑量低於其他疫苗時，本發明之mRNA-LNP調配物仍優於其他疫苗。經10μg或2μg劑量之hMPV融合蛋白mRNA LNP疫苗或PIV3 mRNA LNP疫苗免疫之小鼠產生例如成功中和hMPV B2病毒之中和抗體。10μg劑量之mRNA疫苗保護100%之小鼠免受致命攻毒且在攻毒後劇烈減低病毒效價(減低約2 log)。 |
| [0278] | 兩次20μg劑量之MERS-CoV mRNA LNP疫苗顯著減低病毒負載且誘發顯著量之針對MERS-CoV之中和抗體(EC50在500至1000之間)。MERS-CoV mRNA疫苗誘發之抗體效價比在同一模型中測試之任何其他疫苗要好3至5倍。 |
| [0279] | 本文所述研究中所用之LNP先前已用於在各種動物模型以及人類中傳遞siRNA。鑑於與siRNA傳遞LNP調配物相關進行之觀測，LNP適用於疫苗中之事實相當令人驚訝。已觀察到，治療性 傳遞在LNP中調配之siRNA導致與瞬間IgM反應相關之不利發炎反應，通常導致抗原產生減低及受損之免疫反應。與關於siRNA觀察之結果相反，本發明之LNP-mRNA調配物在本文中證實產生增強之IgG水準，足以用於預防及治療方法而非瞬間IgM反應。 |
| [0280] | 核酸/聚核苷酸 |
| [0281] | 如本文提供之呼吸道病毒疫苗包含至少一種(一或多種)核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼至少一種選自hMPV、PIV3、RSV、MeV及βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)抗原性多肽之抗原性多肽之開放閱讀框架。術語「核酸」包括包含核苷酸(核苷酸單體)聚合物之任何化合物及/或物質。該等聚合物稱為聚核苷酸。因此，術語「核酸」與「聚核苷酸」可互換使用。 |
| [0282] | 核酸可為或可包括例如核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA，包括具有β-D-核糖組態之LNA、具有α-L-核糖組態之α-LNA(LNA之非對映異構體)、具有2'-胺基官能基之2'-胺基-LNA及具有2'-胺基官能基之2'-胺基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、環己烯基核酸(CeNA)或其嵌合體或組合。 |
| [0283] | 在一些實施例中，本發明之聚核苷酸充當信使RNA(mRNA)。「信使RNA」(mRNA)係指編碼(至少一種)多肽(天然產生、非天然產生或經修飾之胺基酸聚合物)且可經轉譯以活體外、活體內、就地或離體產生編碼多肽之任何聚核苷酸。熟習此項技術者將瞭解，除另外說明以外，本申請案中所述之聚核苷酸序列將在代表性DNA序列中列舉「T」，但當序列表示RNA(例如，mRNA)時，「T」將被「U」取代。因此，由特定序列識別號碼標識之 DNA編碼之任意RNA聚核苷酸亦可包含由該DNA編碼之相應RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列之每個「T」被「U」取代。 |
| [0284] | mRNA分子之基本組分通常包括至少一個編碼區、5'非轉譯區(UTR)、3'UTR、5'端帽及聚腺苷酸尾(poly-A尾)。本發明之聚核苷酸可充當mRNA，但在其功能性及/或結構設計特徵方面區別於野生型mRNA，該等特徵用以使用基於核酸之治療來克服有效多肽表現之現有問題。 |
| [0285] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之RNA聚核苷酸編碼2至10種、2至9種、2至8種、2至7種、2至6種、2至5種、2至4種、2至3種、3至10種、3至9種、3至8種、3至7種、3至6種、3至5種、3至4種、4至10種、4至9種、4至8種、4至7種、4至6種、4至5種、5至10種、5至9種、5至8種、5至7種、5至6種、6至10種、6至9種、6至8種、6至7種、7至10種、7至9種、7至8種、8至10種、8至9種或9至10種抗原性多肽。在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼至少10種、20種、30種、40種、50種、60種、70種、80種、90種或100種抗原性多肽。在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼至少100種或至少200種抗原性多肽。在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗之RNA聚核苷酸編碼1至10種、5至15種、10至20種、15至25種、20至30種、25至35種、30至40種、35至45種、40至50種、1至50種、1至100種、2至50種或2至100種抗原性多肽。 |
| [0286] | 在一些實施例中，本發明之聚核苷酸經密碼子最佳化。密碼子最佳化方法在此項技術中已知且可如本文提供來使用。在一些實施例中，密碼子最佳化可用於匹配標靶與宿主有機體中之密碼子頻率以確保適當摺疊；使GC含量出現偏差以增加mRNA穩定性 或減少二級結構；使可損害基因構造或表現之串聯重複密碼子或鹼基運行最小化；定製轉錄及轉譯控制區；插入或移除蛋白運輸序列；移除/添加編碼蛋白中之轉譯後修飾位點(例如，醣苷化位點)；添加、移除或置換蛋白結構域；插入或刪除限制位點；修飾核糖體結合位點及mRNA降解位點；調節轉譯速率以使得蛋白之各種結構域可適當摺疊；或減少或消除聚核苷酸內有問題之二級結構。密碼子最佳化工具、演算法及服務在此項技術中已知-非限制性實例包括來自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)及/或專利方法之服務。在一些實施例中，使用最佳化演算法來最佳化開放閱讀框架(ORF)序列。 |
| [0287] | 在一些實施例中，密碼子最佳化序列與天然產生或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或抗原性多肽)之天然產生或野生型mRNA序列)共有小於95%之序列一致性、小於90%之序列一致性、小於85%之序列一致性、小於80%之序列一致性或小於75%之序列一致性。 |
| [0288] | 在一些實施例中，密碼子最佳化序列與天然產生序列或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然產生或野生型mRNA序列)共有65%與85%之間(例如，約67%與約85%之間或約67%與約80%之間)之序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化序列與天然產生序列或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然產生或野生型mRNA序列)共有65%與75%之間或約80%之序列一致性。 |
| [0289] | 在一些實施例中，密碼子最佳化RNA(例如，mRNA)可為例如其中G/C水準增強之RNA。核酸分子之G/C含量可影響RNA之穩定性。鳥嘌呤(G)及/或胞嘧啶(C)殘基之量增加之RNA在功能方 面可比含有大量腺嘌呤(A)及胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸之核酸更穩定。WO02/098443揭示一種醫藥組合物，其含有在轉譯區藉由序列修飾穩定化之mRNA。由於遺傳密碼退化，修飾藉由以促進更大RNA穩定性而不改變所得胺基酸之彼等密碼子取代現有密碼子來起作用。該方法侷限於RNA之編碼區。 |
| [0290] | 抗原/抗原性多肽 |
| [0291] | 在一些實施例中，抗原性多肽(例如，hMPV、PIV3、RSV、MeV或βCoV抗原性多肽)長於25個胺基酸且短於50個胺基酸。多肽包括基因產物、天然產生之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及以上各物之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。多肽亦可包含單鏈多肽或多鏈多肽，諸如抗體或胰島素，且可彼此締合或連接。最常見地，在多鏈多肽中可見二硫鍵聯。術語「多肽」亦可適用於胺基酸聚合物，其中至少一種胺基酸殘基為相應天然產生之胺基酸之人工化學類似物。 |
| [0292] | 「多肽變異體」為其胺基酸序列區別於天然序列或參考序列之分子。胺基酸序列變異體與天然序列或參考序列相比可在胺基酸序列內之某些位置具備取代、刪除、插入或上述中任意兩者或三者之組合。變異體通常與天然序列或參考序列具備至少50%之一致性。在一些實施例中，變異體與天然序列或參考序列共有至少80%之一致性或至少90%之一致性。 |
| [0293] | 在一些實施例中，提供「變異體模擬物」。「變異體模擬物」含有至少一個將模擬活化序列之胺基酸。例如，麩胺酸可充當偶磷基-蘇胺酸及/或偶磷基-絲胺酸之模擬物。或者，變異體模擬物可導致去活化或導致含有模擬物之不活化產物。例如，苯丙胺酸可充當酪胺酸之不活化取代，或丙胺酸可充當絲胺酸之不活化取 代。 |
| [0294] | 「異種同源物」係指藉由物種形成而自共同祖先基因進化之不同物種的基因。異種同源物在進化過程中通常保持相同功能。標識異種同源物對於可靠預測新測序基因體中之基因功能而言為重要的。 |
| [0295] | 「類似物」欲包括因一或多種胺基酸改變而不同之多肽變異體，該等胺基酸改變例如仍保留母體或起始多肽之一或多種特性的對胺基酸殘基之取代、添加或刪除。 |
| [0296] | 本發明提供若干種類型之組合物，其基於聚核苷酸或多肽，包括變異體及衍生物。該等變異體及衍生物包括例如取代、插入、刪除及共價變異體及衍生物。術語「衍生物」與術語「變異體」同義使用，且通常係指相對於參考分子或起始分子而言以任何方式修飾及/或改變之分子。 |
| [0297] | 因此，本發明之範疇內包括編碼相對於參考序列而言含有取代、插入及/或添加、刪除及共價修飾之肽或多肽(特定而言為本文揭示之多肽序列)之聚核苷酸。例如，可向肽序列(例如，N末端或C末端)添加序列標籤或胺基酸，諸如一或多個離胺酸。序列標籤可用於肽偵測、純化或定位。離胺酸可用於增加肽溶解性或使得可進行生物素標記。或者，位於肽或蛋白之胺基酸序列之羧基及胺基末端區之胺基酸殘基可視情況經刪除以提供截短序列。或者，某些胺基酸(例如，C末端殘基或N末端殘基)可視序列之用途而刪除，例如表現作為具有可溶性或連接至固體支撐物之較大序列之部分的序列。 |
| [0298] | 提及多肽時之「取代變異體」為在天然或起始序列中移除至少一個胺基酸殘基且在其相同位置之處插入不同胺基酸之彼等取代變異體。取代可為單次，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或 取代可為多次的，其中同一分子中兩個或兩個以上(例如，3個、4個或5個)胺基酸經取代。 |
| [0299] | 如本文所用，術語「保守性胺基酸取代」係指以具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸取代序列中正常存在之胺基酸。保守性取代之實例包括以非極性(疏水性)殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸及白胺酸)取代另一非極性殘基。同樣，保守性取代之實例包括以一種極性(親水性)殘基取代另一殘基，諸如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天冬醯胺酸之間及甘胺酸與絲胺酸之間。另外，以諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸之鹼性殘基取代另一者，或以諸如天冬胺酸或麩胺酸之一種酸性殘基取代另一種酸性殘基為保守性取代之其他實例。非保守性取代之實例包括以諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸之非極性(疏水性)胺基酸殘基取代諸如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸之極性(親水性)殘基及/或以極性殘基取代非極性殘基。 |
| [0300] | 提及多肽或聚核苷酸時之「特徵」分別定義為分子之基於不同胺基酸序列或基於核苷酸之組分。由聚核苷酸編碼之多肽特徵包括表面表現、局部構型形狀、摺疊、環、半環、結構域、半結構域、位點、末端及其任意組合。 |
| [0301] | 如本文所用，當提及多肽時，術語「結構域」係指具有一或多種可標識之結構或功能性特徵或特性(例如，結合能力，充當蛋白與蛋白相互作用之位點)之多肽基序。 |
| [0302] | 如本文所用，當提及多肽時，術語「位點」在其關於基於胺基酸之實施例時與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義使用。如本文所用，當提及聚核苷酸時，術語「位點」在其關於基於核苷酸之實施例時與「核苷酸」同義使用。位點表示在基於多肽或基於聚核苷酸之分子中可經修飾、操作、變化、衍生或改變的肽 或多肽或聚核苷酸中之位置。 |
| [0303] | 如本文所用，當提及多肽或聚核苷酸時，術語「末端(termini或terminus)」分別係指多肽或聚核苷酸之端點。該等端點不僅侷限於多肽或聚核苷酸之第一或最終位點，而且可包括末端區域中之其他胺基酸或核苷酸。基於多肽之分子可表徵為具有N末端(由具有游離胺基(NH2)之胺基酸封端)及C末端(由具有游離羧基(COOH)之胺基酸封端)。蛋白在某些情形下由藉由雙硫鍵或藉由非共價力(多聚體、寡聚物)結合在一起之多個多肽鏈組成。該等蛋白具有多個N末端及C末端。或者，視情況而定，多肽之末端可經修飾以便其可由基於非多肽之部分開始或結束，諸如有機結合物。 |
| [0304] | 如熟習此項技術者所公認，蛋白片段、功能性蛋白結構域及同源蛋白亦認為在所關注多肽之範疇內。舉例而言，本文提供長度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或長於100個胺基酸之參考蛋白的任何蛋白片段(意謂比參考多肽序列短至少一個胺基酸殘基但其他方面均相同之多肽序列)。在另一實例中，根據本發明可使用包括與本文所述任何序列40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的20、30、40、50或100個(連續)胺基酸延伸段之任何蛋白。在一些實施例中，多肽包括如本文提供或本文參考之任何序列中所示之2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上突變。在另一實施例中，根據本發明可使用包括與本文所述任何序列大於80%、90%、95%或100%一致的20、30、40、50或100個胺基酸延伸段之任何蛋白，其中該蛋白具有與本文所述任何序列小於80%、75%、70%、65%至60%一致性之5、10、15、20、25或30個胺基酸延伸段。 |
| [0305] | 本發明之多肽或聚核苷酸分子與參考分子(例如，參考多肽 或參考聚核苷酸)，例如與此項技術中所述之分子(例如，工程化或經設計之分子或野生型分子)可共有一定程度之序列類似性或一致性。如此項技術中已知，術語「一致性」係指如藉由對比序列所確定，兩個或兩個以上多肽或聚核苷酸序列之間的關係。在此項技術中，一致性亦意謂如由兩個或兩個以上胺基酸殘基或核酸殘基串之間之匹配數所確定之兩個序列間的序列相關程度。一致性量測兩個或兩個以上序列中具有由特定數學模型或電腦程式(例如，「演算法」)提出之空隙比對(若存在任何)之較小者之間的一致匹配百分比。相關肽之一致性可易於由已知方法來計算。「一致性%」在應用於多肽或聚核苷酸序列時定義為在比對序列且引入空隙(若必要)以實現最大一致性百分比之後，候選胺基酸或核酸序列中與第二序列之胺基酸序列或核酸序列中之殘基一致之殘基(胺基酸殘基或核酸殘基)的百分比。用於比對之方法及電腦程式在此項技術中熟知。一致性取決於一致性百分比之計算，但由於計算中引入空隙及處罰，因此其值可不同。通常，如本文所述且熟習此項技術者已知之序列比對程式及參數所確定，特定聚核苷酸或多肽變異體與該特定參考聚核苷酸或多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%但小於100%之序列一致性。用於比對之該等工具包括BLAST套組之彼等(Stephen F.Altschul，等人(1997).「Gapped BLAST及PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一種流行之局部比對技術係基於Smith-Waterman演算法(Smith,T.F.及Waterman,M.S.(1981)「Identification of common molecular subsequences.」J.Mol.Biol.147：195-197)。一種基於動態程式化之通用全局比對技術為 Needleman-Wunsch演算法(Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(1970)「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins」J.Mol.Biol.48：443-453)。最近研發出一種快速最佳化全局序列比對演算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，據稱其比其他最佳化全局比對方法(包括Needleman-Wunsch演算法)更快地產生對核苷酸及蛋白序列之全局比對。本文中描述其他工具，尤其在下文「一致性」之定義中。 |
| [0306] | 如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間之總體相關性。共有由比對匹配殘基所確定之臨限水準類似性或一致性之聚合分子(例如，核酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子)稱為同源的。同源性為描述分子間關係之定量術語且可基於定量類似性或一致性。類似性或一致性為定義兩個比較序列間之序列匹配程度的定量術語。在一些實施例中，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則認為其彼此「同源」。術語「同源」必然係指至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的對比。若兩個聚核苷酸序列編碼之多肽中至少20個胺基酸之至少一個延伸段至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%一致，則認為該兩個聚核苷酸序列同源。在一些實施例中，同源聚核苷酸序列由其編碼至少4至5個獨特規定胺基酸之延伸段的能力來表徵。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列而言，由其編碼至少4至5個獨特規定胺基酸之延伸段的能力來確定同源性。若兩種蛋白中至少20個胺基酸之至少一個延伸段至少50%、60%、70%、80%或90%一致，則 認為該兩種蛋白序列同源。 |
| [0307] | 同源性暗示對比之序列在自共同來源進化中出現分歧。術語「同源物」係指與源自共同祖先序列之第二胺基酸序列或核酸序列相關之第一胺基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白序列)。術語「同源物」可適用於藉由物種形成事件而分離之基因及/或蛋白之間的關係或適用於藉由遺傳複製事件而分離之基因及/或蛋白之間的關係。「異種同源物」為藉由物種形成而自共同祖先基因(或蛋白)進化之不同物種的基因(或蛋白)。異種同源物在進化過程中通常保持相同功能。「同種同源物」為藉由在基因體內複製而相關之基因(或蛋白)。異種同源物在進化過程中保留相同功能，而同種同源物進化出新功能，即使該等新功能與初始功能相關。 |
| [0308] | 術語「一致性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間之總體相關性。可藉由比對兩個聚核酸序列來對兩個序列之一致性百分比進行計算以用於最佳比較目的(例如，可向第一及第二核酸序列之一者或兩者中引入空隙以用於最佳比對且可忽視非一致序列以用於比較目的)。在某些實施例中，經比對用於比較目的之序列長度為參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。隨後比較相應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置之相同核苷酸佔據時，則該等分子在此位置處一致。兩個序列之間之一致性百分比為序列所共有之一致位置數量的函數，考慮空隙之數量及每個空隙之長度，其需要引入以最佳比對兩個序列。可使用數學演算法來完成對序列之比較及兩個序列之間一致性百分比之確定。例如，可使用諸如以下文獻中所述之彼 等方法來確定兩個核酸序列之間之一致性百分比：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編，Oxford University Press,New York、1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press、1987；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey,1994；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編，M Stockton Press,New York,1991；其各自以引用之方式併入本文中。例如，可使用Meyers及Miller之演算法(CABIOS，1989,4：11-17)來確定兩個核酸序列之間之一致性百分比，其已併入使用PAM120重量殘基表、12之空隙長度處罰及4之空隙處罰的ALIGN程式(2.0版)中。或者，可使用在使用NWSgapdna.CMP基質之GCG軟體封裝中的GAP程式來確定兩個核酸序列之間之一致性百分比。通常用於確定序列間一致性百分比之方法包括(但不限於)Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48：1073(1988)中所述之彼等方法；其以引用之方式併入本文中。用於確定一致性之技術在公開可用之電腦程式中編碼。用於確定兩個序列之間同源性之例示性電腦軟體包括(但不限於)GCG程式封裝、Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215,403(1990))。 |
| [0309] | 多蛋白及多組分疫苗 |
| [0310] | 本發明涵蓋包含各自編碼單一抗原性多肽之多個RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的呼吸道病毒疫苗以及包含編碼一種以上抗原性多肽(例如，融合多肽形式)之單一RNA聚核苷酸的呼吸道病 毒疫苗。因此，包含具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸及具有編碼第二抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的疫苗組合物涵蓋(a)包含編碼第一抗原性多肽之第一RNA聚核苷酸及編碼第二抗原性多肽之第二RNA聚核苷酸的疫苗，及(b)包含編碼第一及第二抗原性多肽(例如，融合多肽形式)之單一RNA聚核苷酸的疫苗。在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗包含2至10種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10種)或10種以上具有開放閱讀框架之RNA聚核苷酸，其各自編碼不同之抗原性多肽(或編碼2至10種或10種以上不同抗原性多肽之單一RNA聚核苷酸)。抗原性多肽可選自hMPV、PIV3、RSV、MEV及βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)抗原性多肽。 |
| [0311] | 在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗包含具有編碼病毒衣殼蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸、具有編碼病毒前膜/膜蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸及具有編碼病毒包膜蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，呼吸道病毒疫苗包含具有編碼病毒融合(F)蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸及具有編碼病毒主要表面醣蛋白(G蛋白)之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，疫苗包含具有編碼病毒F蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，疫苗包含具有編碼病毒G蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。在一些實施例中，疫苗包含具有編碼HN蛋白之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0312] | 在一些實施例中，多組分疫苗包含至少一種編碼至少一種與 信號肽(例如，SEQ ID NO：15至19中之任一者)融合之抗原性多肽的RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。信號肽可在抗原性多肽之N末端或C末端融合。與信號肽融合之抗原性多肽可選自hMPV、PIV3、RSV、MEV及βCoV(例如，選自MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及HCoV-HKU1)抗原性多肽。 |
| [0313] | 信號肽 |
| [0314] | 在一些實施例中，由呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼之抗原性多肽包含信號肽。在N末端包含蛋白之15至60個胺基酸的信號肽通常需要經分泌途徑跨膜移位，且因此普遍地控制真核細胞及原核細胞中之大多數蛋白進入分泌途徑。信號肽通常包括三個區域：具有不同長度之N末端區域，其通常包含帶正電荷之胺基酸；疏水性區域；及短羧基末端肽區域。在真核細胞中，初生前驅體蛋白(前蛋白)之信號肽將核糖體導向粗糙內質網(ER)膜且開始經其傳輸生長之肽鏈以供加工。ER加工產生成熟蛋白，其中信號肽通常由宿主細胞之ER保留信號肽酶而自前驅體蛋白裂解，或其保持不裂解且充當膜錨。信號肽亦可促使將蛋白標靶至細胞膜。然而，信號肽不負責成熟蛋白之最終目標。在其序列中不含其他地址標籤之分泌型蛋白默認經分泌至外部環境。近年來，關於信號肽已演變出一種更先進之觀點，表明某些信號肽之功能及免疫優勢比先前預期之更多樣得多。 |
| [0315] | 本發明之呼吸道病毒疫苗可包含例如編碼人工信號肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其中該信號肽編碼序列可操作性地連接至抗原性多肽之編碼序列且與其同框。因此，在一些實施例中，本發明之呼吸道病毒疫苗產生包含與信號肽融合之抗原性多肽(例如，hMPV、PIV3、RSV、MeV或βCoV)之抗原性多肽。在 一些實施例中，信號肽與抗原性多肽之N末端融合。在一些實施例中，信號肽與抗原性多肽之C末端融合。 |
| [0316] | 在一些實施例中，與抗原性多肽融合之信號肽為人工信號肽。在一些實施例中，與由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之抗原性多肽融合之人工信號肽由免疫球蛋白獲得，例如IgE信號肽或IgG信號肽。在一些實施例中，與由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之抗原性多肽融合之信號肽為具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：16)之Ig重鏈ε-1信號肽(IgE HC SP)。在一些實施例中，與由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之抗原性多肽融合之信號肽為具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：15)之IgGk鏈V-III區HAH信號肽(IgGk SP)。在一些實施例中，信號肽係選自：日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：17)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：18)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：19)。 |
| [0317] | 在一些實施例中，由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之抗原性多肽包含與由SEQ ID NO：15至19(表8)中任一者標識之信號肽融合之由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34、47至50或54至56中任一者標識之胺基酸序列(表3、6、11、14或17；亦參見表4、7、12或15之胺基酸序列)。本文揭示之實例不欲限制且根據本發明可使用此項技術中已知促使將蛋白標靶至ER以供加工及/或促使將蛋白標靶至細胞膜之任何信號肽。 |
| [0318] | 信號肽可具有15至60個胺基酸之長度。例如，信號肽可具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個胺基酸之長度。在一些實施例中，信號肽具有20至60、25至60、30至60、35至60、40至60、45至60、50至60、55至60、15至55、20至55、25至55、30至55、35至55、40至55、45至55、50至55、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、15至45、20至45、25至45、30至45、35至45、40至45、15至40、20至40、25至40、30至40、35至40、15至35、20至35、25至35、30至35、15至30、20至30、25至30、15至25、20至25或15至20個胺基酸之長度。 |
| [0319] | 信號肽通常在ER加工期間在裂解接合處由初生多肽裂解。由本發明之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗產生之成熟抗原性多肽通常不包含信號肽。 |
| [0320] | 化學修飾 |
| [0321] | 在一些實施例中，本發明之呼吸道病毒疫苗包含具有編碼至少一種包含至少一個化學修飾之抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。 |
| [0322] | 術語「化學修飾」及「經化學修飾之」係指關於腺苷(A)、鳥苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞嘧啶核苷(C)核糖核苷或去氧核糖核苷對其位置、圖案、百分比或群體之至少一者之修飾。通常，該等術語不係指對天然產生之5'-末端mRNA端帽部分之核糖核苷酸修飾。關於多肽，術語「修飾」係指相對於典型集合20個胺基酸而言之修飾。如本文提供之多肽若含有胺基酸取代、插入或取代與插入之組合，則亦認為其「經修飾」。 |
| [0323] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含各種(一種以上)不同修飾。在一些實施例中，特定區域之聚核苷酸含有一個、兩個或兩個以上(視情況不 同之)核苷或核苷酸修飾。在一些實施例中，引入細胞或有機體中之經修飾之RNA聚核苷酸(例如，經修飾之mRNA聚核苷酸)在細胞或有機體中相對於未經修飾之聚核苷酸而言分別展現降解減少。在一些實施例中，引入細胞或有機體中之經修飾之RNA聚核苷酸(例如，經修飾之mRNA聚核苷酸)在細胞或有機體中可分別展現免疫原性減小(例如，固有之反應減少)。 |
| [0324] | 聚核苷酸之修飾包括(不限於)本文所述之彼等修飾。聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)可包含天然產生、非天然產生之修飾或聚核苷酸可包含天然產生與非天然產生修飾之組合。聚核苷酸可包括例如對糖、核鹼基或核苷間鍵聯(例如，對連接之磷酸酯、對磷酸二酯鍵聯或對磷酸二酯主鏈)之任何適用之修飾。 |
| [0325] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含在聚核苷酸合成期間或在聚核苷酸合成後引入之經非天然修飾之核苷酸以達成所需之功能或特性。修飾可呈現於核苷酸間鍵聯、嘌呤或嘧啶鹼基或糖上。修飾可經化學合成或經聚合酶在鏈末端或鏈之任意其他處引入。聚核苷酸之任何區域均可經化學修飾。 |
| [0326] | 本發明提供聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)之經修飾之核苷及核苷酸。「核苷」係指與有機鹼基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中亦稱為「核鹼基」)組合之含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物之化合物。「核苷酸」係指核苷，包括磷酸酯基團。經修飾之核苷酸可藉由諸如化學、酶促或重組之任何適用方法合成以包括一或多種經修飾或非天然之核苷。聚核苷酸可包含鍵聯核苷之一或多個區域。該等區域可具有可變之主鏈鍵聯。該等鍵聯可為標準之磷酸二酯鍵聯，在此情形 下聚核苷酸將包含核苷酸區域。 |
| [0327] | 經修飾之核苷酸鹼基配對不僅涵蓋標準腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鳥苷-胞嘧啶鹼基對，而且涵蓋在核苷酸及/或經修飾之核苷酸之間形成之包含非標準或經修飾鹼基之鹼基對，其中氫鍵供體與氫鍵受體之排列允許在非標準鹼基與標準鹼基之間或在兩個互補非標準鹼基結構之間氫鍵結。該非標準鹼基配對之一種實例為經修飾之核苷酸肌苷與腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之間之鹼基配對。鹼基/糖或連接子之任意組合均可併入本發明之聚核苷酸中。 |
| [0328] | 適用於本發明之疫苗中之聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)修飾包括(但不限於)以下：2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N6-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；N6-甘胺酸基胺甲醯基腺苷；N6-異戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；1,2'-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷；2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；異戊烯基腺苷；N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,N6,2'-O-三甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6-乙醯基腺苷；N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷；N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷；7-去氮雜-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6(二甲基)腺嘌呤；N6-順-羥基-異戊烯基-腺苷；α-硫基-腺苷；2(胺基)腺嘌呤；2(胺基丙基)腺嘌呤；2(甲硫基)N6(異戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(胺基烷基)腺嘌呤；2-(胺基丙基)腺嘌呤；2-(鹵基)腺嘌呤；2-(鹵基)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2’-胺基-2’-去氧基 -ATP；2’-疊氮基-2’-去氧基-ATP；2'-去氧基-2'-a-胺基腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮雜)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(胺基)腺嘌呤；8(硫烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(胺基)腺嘌呤；8-(鹵基)腺嘌呤；8-(羥基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-疊氮基-腺苷；氮雜腺嘌呤；去氮雜腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(異戊基)腺嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮雜腺苷TP；2’氟-N6-Bz-去氧基腺苷TP；2’-OMe-2-胺基-ATP；2’O-甲基-N6-Bz-去氧基腺苷TP；2'-a-乙炔基腺苷TP；2-胺基腺嘌呤；2-胺基腺苷TP；2-胺基-ATP；2'-a-三氟甲基腺苷TP；2-疊氮基腺苷TP；2'-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巰基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮雜-3-溴腺苷TP；3-去氮雜-3-氯腺苷TP；3-去氮雜-3-氟腺苷TP；3-去氮雜-3-碘腺苷TP；3-去氮雜腺苷TP；4'-疊氮基腺苷TP；4'-碳環腺苷TP；4'-乙炔基腺苷TP；5'-高-腺苷TP；8-氮雜-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮雜腺苷TP；2-胺基嘌呤；7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基嘌呤；2-硫 基胞嘧啶核苷；3-甲基胞嘧啶核苷；5-甲醯基胞嘧啶核苷；5-羥甲基胞嘧啶核苷；5-甲基胞嘧啶核苷；N4-乙醯基胞嘧啶核苷；2'-O-甲基胞嘧啶核苷；2'-0-甲基胞嘧啶核苷；5,2'-O-二甲基胞嘧啶核苷；5-甲醯基-2'-O-甲基胞嘧啶核苷；立西啶(Lysidine)；N4,2'-O-二甲基胞嘧啶核苷；N4-乙醯基-2'-O-甲基胞嘧啶核苷；N4-甲基胞嘧啶核苷；N4,N4-二甲基-2’-OMe-胞嘧啶核苷TP；4-甲基胞嘧啶核苷；5-氮雜-胞嘧啶核苷；假-異-胞嘧啶核苷；吡咯并-胞嘧啶核苷；α-硫基-胞嘧啶核苷；2-(硫基)胞嘧啶；2’-胺基-2’-去氧基-CTP；2’-疊氮基-2’-去氧基-CTP；2'-去氧基-2'-a-胺基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基胞嘧啶核苷TP；3(去氮雜)5(氮雜)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮雜)5(氮雜)胞嘧啶；3-(甲基)胞嘧啶核苷；4,2'-O-二甲基胞嘧啶核苷；5(鹵基)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(鹵基)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞嘧啶核苷；5-碘-胞嘧啶核苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮基)胞嘧啶；6-氮雜-胞嘧啶核苷；氮雜胞嘧啶；去氮雜胞嘧啶；N4(乙醯基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮雜-假異胞嘧啶核苷；1-甲基-假異胞嘧啶核苷；2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶核苷；2-甲氧基-胞嘧啶核苷；2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷；4-甲氧基-1-甲基-假異胞嘧啶核苷；4-甲氧基-假異胞嘧啶核苷；4-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假異胞嘧啶核苷；4-硫基-1-甲基-假異胞嘧啶核苷；4-硫基-假異胞嘧啶核苷；5-氮雜-澤布拉林(zebularine)；5-甲基-澤布拉林；吡咯并-假異胞嘧啶核苷；澤布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞嘧啶核苷TP；2,2’-脫水-胞嘧啶核苷TP鹽酸鹽；2’氟-N4-Bz-胞嘧啶核苷TP；2’氟-N4-乙醯基-胞嘧啶核苷TP；2’-O-甲基-N4-乙醯基-胞嘧啶核苷TP；2’O-甲基-N4- Bz-胞嘧啶核苷TP；2'-a-乙炔基胞嘧啶核苷TP；2'-a-三氟甲基胞嘧啶核苷TP；2'-b-乙炔基胞嘧啶核苷TP；2'-b-三氟甲基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基胞嘧啶核苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基胞嘧啶核苷TP；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞嘧啶核苷TP；3'-乙炔基胞嘧啶核苷TP；4'-疊氮基胞嘧啶核苷TP；4'-碳環胞嘧啶核苷TP；4'-乙炔基胞嘧啶核苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-胞嘧啶核苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫基胞嘧啶核苷TP；5-(4-胺基-苯基)-2-硫基胞嘧啶核苷TP；5-胺基烯丙基-CTP；5-氰基胞嘧啶核苷TP；5-乙炔基阿糖-胞嘧啶核苷TP；5-乙炔基胞嘧啶核苷TP；5'-高-胞嘧啶核苷TP；5-甲氧基胞嘧啶核苷TP；5-三氟甲基-胞嘧啶核苷TP；N4-胺基-胞嘧啶核苷TP；N4-苄醯基-胞嘧啶核苷TP；假異胞嘧啶核苷；7-甲基鳥苷；N2,2'-O-二甲基鳥苷；N2-甲基鳥苷；懷俄苷(Wyosine)；1,2'-O-二甲基鳥苷；1-甲基鳥苷；2'-O-甲基鳥苷；2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)；2'-O-甲基鳥苷；2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)；7-胺基甲基-7-去氮雜鳥苷；7-氰基-7-去氮雜鳥苷；古嘌苷(Archaeosine)；甲基懷俄苷；N2,7-二甲基鳥苷；N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷；N2,N2,7-三甲基鳥苷；N2,N2-二甲基鳥苷；N2,7,2'-O-三甲基鳥苷；6-硫基-鳥苷；7-去氮雜-鳥苷；8-側氧基-鳥苷；N1-甲基-鳥苷；α-硫基-鳥苷；2(丙基)鳥嘌呤；2-(烷基)鳥嘌呤；2’-胺基-2’-去氧基-GTP；2’-疊氮基-2’-去氧基-GTP；2'-去氧基-2'-a-胺基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基鳥苷TP；6(甲基)鳥嘌呤；6-(烷 基)鳥嘌呤；6-(甲基)鳥嘌呤；6-甲基-鳥苷；7(烷基)鳥嘌呤；7(去氮雜)鳥嘌呤；7(甲基)鳥嘌呤；7-(烷基)鳥嘌呤；7-(去氮雜)鳥嘌呤；7-(甲基)鳥嘌呤；8(烷基)鳥嘌呤；8(炔基)鳥嘌呤；8(鹵基)鳥嘌呤；8(硫烷基)鳥嘌呤；8-(烯基)鳥嘌呤；8-(烷基)鳥嘌呤；8-(炔基)鳥嘌呤；8-(胺基)鳥嘌呤；8-(鹵基)鳥嘌呤；8-(羥基)鳥嘌呤；8-(硫烷基)鳥嘌呤；8-(硫醇)鳥嘌呤；氮雜鳥嘌呤；去氮雜鳥嘌呤；N(甲基)鳥嘌呤；N-(甲基)鳥嘌呤；1-甲基-6-硫基-鳥苷；6-甲氧基-鳥苷；6-硫基-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷；6-硫基-7-去氮雜-鳥苷；6-硫基-7-甲基-鳥苷；7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷；7-甲基-8-側氧基-鳥苷；N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷；N2-甲基-6-硫基-鳥苷；1-Me-GTP；2’氟-N2-異丁基-鳥苷TP；2’O-甲基-N2-異丁基-鳥苷TP；2'-a-乙炔基鳥苷TP；2'-a-三氟甲基鳥苷TP；2'-b-乙炔基鳥苷TP；2'-b-三氟甲基鳥苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基鳥苷TP；4'-疊氮基鳥苷TP；4'-碳環鳥苷TP；4'-乙炔基鳥苷TP；5'-高-鳥苷TP；8-溴-鳥苷TP；9-去氮雜鳥苷TP；N2-異丁基-鳥苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；環氧基Q核苷(Epoxyqueuosine)；半乳糖基-Q核苷；甘露糖基Q核苷；Q核苷；烯丙基胺基-胸苷；氮雜胸苷；去氮雜胸苷；去氧-胸苷；2’-O-甲基尿苷；2-硫尿苷；3-甲基尿苷；5-羧基甲基尿苷；5-羥基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氫尿苷；假尿苷；(3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-胺 基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-甲基-假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫基-2'-O-甲基尿苷；3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫尿苷；5-(羧基羥甲基)尿苷；5-(羧基羥甲基)尿苷甲酯；5,2'-O-二甲基尿苷；5,6-二氫-尿苷；5-胺基甲基-2-硫尿苷；5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-胺甲醯基甲基尿苷；5-羧基羥甲基尿苷；5-羧基羥甲基尿苷甲酯；5-羧基甲胺基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-羧基甲胺基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲胺基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲胺基甲基尿苷；5-羧基甲胺基甲基尿苷；5-胺甲醯基甲基尿苷TP；5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-甲胺基甲基-2-硒基尿苷；5-甲胺基甲基-2-硫尿苷；5-甲胺基甲基尿苷；5-甲基二氫尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿苷；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；3-(3-胺基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫基-尿苷；1(胺基烷胺基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(胺基烷胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1(胺基烷胺基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(胺基烷胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1經取代之2(硫基)-假尿嘧啶；1經取代之2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1經取代之4(硫基)假尿嘧啶；1經取代之假尿嘧啶；1-(胺基烷胺基-羰基乙烯基)-2-(硫基)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假- UTP；1-甲基-假-UTP；2(硫基)假尿嘧啶；2'去氧基尿苷；2'氟尿苷；2-(硫基)尿嘧啶；2,4-(二硫基)假尿嘧啶；2’甲基、2’胺基、2’疊氮基、2’氟-鳥苷；.2’-胺基-2’-去氧基-UTP；2’-疊氮基-2’-去氧基-UTP；2’-疊氮基-去氧基尿苷TP；2’-O-甲基假尿苷；2'去氧基尿苷；2'氟尿苷；2'-去氧基-2'-a-胺基尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3胺基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)尿嘧啶；4-硫基尿嘧啶；5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-胺基丙基)尿嘧啶；5(胺基烷基)尿嘧啶；5(二甲胺基烷基)尿嘧啶；5(胍鎓烷基)尿嘧啶；5(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5(甲基)2,4(二硫基)尿嘧啶；5(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-2,4(二硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-4(硫基)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-胺基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基胺基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷胺基烷基)尿嘧啶；5-(二甲胺基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(鹵基)尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)2,4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-2,4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-胺基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷； 5-尿嘧啶；6(偶氮基)尿嘧啶；6-(偶氮基)尿嘧啶；6-氮雜-尿苷；烯丙基胺基-尿嘧啶；氮雜尿嘧啶；去氮雜尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫基-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮雜-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫基-假尿苷；2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷；2-硫基-1-甲基-假尿苷；2-硫基-5-氮雜-尿苷；2-硫基-二氫假尿苷；2-硫基-二氫尿苷；2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫基-1-甲基-假尿苷；4-硫基-假尿苷；5-氮雜-尿苷；二氫假尿苷；(±)1-(2-羥丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羥丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羥丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-胺基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-胺基-乙基)假-UTP；1-(2-羥乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-雙-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3,4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-胺基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-胺基-丙基)假-UTP；1-(3-環丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-胺基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-胺基-苄基)假-UTP；1-(4-胺基-丁基)假-UTP；1-(4-胺基-苯基)假-UTP；1-(4-疊氮基苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺醯基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1- (4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫基甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-胺基-戊基)假-UTP；1-(6-胺基-己基)假-UTP；1,6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-胺基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙醯基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-胺基乙氧基)-乙氧基]-丙醯基}假尿苷TP；1-乙醯基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-胺基甲基-假-UTP；1-苄醯基假尿苷TP；1-苄氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-環丁基甲基-假-UTP；1-環丁基-假-UTP；1-環庚基甲基-假-UTP；1-環庚基-假-UTP；1-環己基甲基-假-UTP；1-環己基-假-UTP；1-環辛基甲基-假-UTP；1-環辛基-假-UTP；1-環戊基甲基-假-UTP；1-環戊基-假-UTP；1-環丙基甲基-假-UTP；1-環丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羥甲基假尿苷TP；1-異-丙基-假-UTP；1-Me-2-硫基-假-UTP；1-Me-4-硫基-假-UTP；1-Me-α-硫基-假-UTP；1-甲磺醯基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2,2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-嗎啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫基嗎啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(經取代之苯基)假-UTP；1-甲基-6-胺基-假-UTP；1-甲基-6-疊氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲胺基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙 基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲醯基-假-UTP；1-甲基-6-羥基胺基-假-UTP；1-甲基-6-羥基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-異-丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲胺基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-第三丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-嗎啉基甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-三甲基乙醯基假尿苷TP；1-丙炔基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-對甲苯基-假-UTP；1-第三丁基-假-UTP；1-硫基甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫基嗎啉基甲基假尿苷TP；1-三氟乙醯基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2’-脫水-尿苷TP；2’-溴-去氧基尿苷TP；2’-F-5-甲基-2’-去氧基-UTP；2’-OMe-5-Me-UTP；2’-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2'-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫基-尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-疊氮基尿苷TP；4'-碳環尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲胺基尿苷TP；5'-高-尿苷TP；5-碘-2’-氟-去氧基尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-嗎啉基)-假-UTP；6-(4-硫基嗎啉基)-假-UTP；6-(經取代之苯基)-假-UTP；6- 胺基-假-UTP；6-疊氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲胺基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲醯基-假-UTP；6-羥基胺基-假-UTP；6-羥基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-異-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲胺基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-第三丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫基-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-對苯甲酸；假-UTP-N1-對苯甲酸；懷丁苷(Wybutosine)；羥基懷丁苷；異懷俄苷(Isowyosine)；過氧基懷丁苷；未完全修飾之羥基懷丁苷；4-去甲基懷俄苷；2,6-(二胺基)嘌呤；1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基：1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮雜)-2,6-(二氧雜)-萘；2(胺基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2‘甲基、2’胺基、2’疊氮基、2’氟-胞嘧啶核苷；2’甲基、2’胺基、2’疊氮基、2’氟-腺嘌呤；2’甲基、2’胺基、2’疊氮基、2’氟-尿苷；2'-胺基-2'-去氧基核糖；2-胺基-6-氯-嘌呤；2-氮雜-肌苷基；2'-疊氮基-2'-去氧基核糖；2'氟-2'-去氧基核糖；2'-氟-修飾之鹼基；2'-O-甲基-核糖；2-側氧基-7-胺基吡啶并嘧啶-3- 基；2-側氧基-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)異喹諾酮；3-(甲基)異喹諾酮；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5經取代之嘧啶；5-(甲基)異喹諾酮；5-硝基吲哚；6-(氮雜)嘧啶；6-(偶氮基)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮雜)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(氮雜)吲哚基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基-羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(丙炔基)異喹諾酮；7-(丙炔基)異喹諾酮、丙炔基-7-(氮雜)吲哚基；7-去氮雜-肌苷基；7-經取代之1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-經取代之1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；胺基吲哚基；蒽基；雙-鄰-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；雙-鄰位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黃嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；異喹諾酮；異鳥苷；N2-經取代之嘌呤；N6-甲基-2-胺基-嘌呤；N6-經取代之嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；努布拉林(Nubularine)；O6-經取代之嘌呤；O-烷基化衍生物；鄰-(胺基烷 基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；鄰位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代間型黴素(Oxoformycin)TP；對-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；對位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；苯蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮雜)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧基-7-胺基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；芪基；經取代之1,2,4-三唑；并四苯基；殺結核菌素(Tubercidine)；黃嘌呤；黃嘌呤核苷-5’-TP；2-硫基-澤布拉林；5-氮雜-2-硫基-澤布拉林；7-去氮雜-2-胺基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-胺基-核糖苷-TP；間型黴素A TP；間型黴素B TP；吡咯核苷(Pyrrolosine)TP；2'-OH-阿糖-腺苷TP；2'-OH-阿糖-胞嘧啶核苷TP；2'-OH-阿糖-尿苷TP；2'-OH-阿糖-鳥苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)腺苷TP。 |
| [0329] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。 |
| [0330] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)中經修飾之核鹼基選自由以下組成之群：假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包括至少兩種(例如，2 種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。 |
| [0331] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)中經修飾之核鹼基選自由以下組成之群：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫基-鳥苷及α-硫基-腺苷。在一些實施例中，聚核苷酸包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。 |
| [0332] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含假尿苷(ψ)及5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)及5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含2-硫尿苷(s2U)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含2-硫尿苷及5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)及5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含2’-O-甲基尿苷及5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)及5-甲基-胞嘧啶核 苷(m5C)。 |
| [0333] | 在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)經均勻修飾(例如，完全修飾、在整個序列中經修飾)以用於特定修飾。例如，聚核苷酸可經5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)均勻修飾，意謂mRNA序列中之所有胞嘧啶殘基經5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)置換。類似地，聚核苷酸可藉由經諸如上文所述之彼等經修飾殘基置換而經均勻修飾為序列中存在之任意類型之核苷殘基。 |
| [0334] | 具有經修飾之胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括N4-乙醯基-胞嘧啶核苷(ac4C)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、5-鹵基-胞嘧啶核苷(例如，5-碘-胞嘧啶核苷)、5-羥甲基-胞嘧啶核苷(hm5C)、1-甲基-假異胞嘧啶核苷、2-硫基-胞嘧啶核苷(s2C)及2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷。 |
| [0335] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之胞嘧啶。具有經修飾之尿苷之例示性核鹼基及核苷包括5-氰基尿苷及4’-硫基尿苷。 |
| [0336] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之腺嘌呤。具有經修飾之腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括7-去氮雜-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)及N6-甲基-腺苷(m6A)。 |
| [0337] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、7-去氮雜-鳥苷、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、7-甲基-鳥苷(m7G)、1-甲基-鳥苷(m1G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷。 |
| [0338] | 本發明之聚核苷酸可沿整個分子長度經部分或完全修飾。例 如，一或多種或所有或給定類型之核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任一或多種或所有A、G、U、C)在本發明之聚核苷酸中或在其給定之預定序列區中均可經均勻修飾(例如，在包括或排除聚腺苷酸尾之mRNA中)。在一些實施例中，本發明之聚核苷酸(或其給定序列區)中之所有核苷酸X均為經修飾之核苷酸，其中X可核苷酸A、G、U、C中之任一者或組合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中之任一者。 |
| [0339] | 聚核苷酸可含有約1%至約100%經修飾之核苷酸(關於總體核苷酸含量而言或關於一或多種類型之核苷酸而言，亦即A、G、U或C中之任一或多個)或任何介於中間之百分比(例如，1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%)。未經修飾之A、G、U或C之存在佔據任何剩餘之百分比。 |
| [0340] | 聚核苷酸可含有最小1%且最大100%經修飾之核苷酸或任何介於中間之百分比，諸如至少5%經修飾之核苷酸、至少10%經修飾之核苷酸、至少25%經修飾之核苷酸、至少50%經修飾之核苷酸、至少80%經修飾之核苷酸或至少90%經修飾之核苷酸。例如，聚核苷酸可含有經修飾之嘧啶，諸如經修飾之尿嘧啶或胞嘧啶。在一些實施例中，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少 25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%之尿嘧啶由經修飾之尿嘧啶(例如，5-經取代之尿嘧啶)置換。經修飾之尿嘧啶可由具有單一獨特結構之化合物置換，或可由多種具有不同結構(例如，2種、3種、4種或4種以上獨特結構)之化合物置換。在一些實施例中，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%之胞嘧啶由經修飾之胞嘧啶(例如，5-經取代之胞嘧啶)置換。經修飾之胞嘧啶可由具有單一獨特結構之化合物置換，或可由多種具有不同結構(例如，2種、3種、4種或4種以上獨特結構)之化合物置換。 |
| [0341] | 因此，在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包含5'UTR元件、視情況經密碼子最佳化之開放閱讀框架及3'UTR元件、poly(A)序列及/或多腺苷酸化信號，其中RNA未經化學修飾。 |
| [0342] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之尿嘧啶。具有經修飾之尿嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷(s2U)、4-硫基-尿苷(s4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羥甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm5s2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿苷(nm5s2U)、5-甲胺基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲胺基甲基-2-硫基-尿苷(mnm5s2U)、5-甲胺基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲胺基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲胺基甲基-2-硫基-尿苷 (cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷(τm5S2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，亦即具有核鹼基去氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m5D)、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿苷(inm5s2U)、α-硫基-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)及5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫基-尿苷、去氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷及5-[3-(1-E-丙烯基胺基)]尿苷。 |
| [0343] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之胞嘧啶。具有經修飾之胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括5-氮雜-胞嘧啶核苷、6-氮雜-胞嘧啶核苷、假異胞嘧啶核苷、3-甲基-胞嘧啶核苷(m3C)、N4-乙醯基-胞嘧啶核苷(ac4C)、5-甲醯基-胞嘧啶核苷(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶核苷(m4C)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、5- 鹵基-胞嘧啶核苷(例如，5-碘-胞嘧啶核苷)、5-羥甲基-胞嘧啶核苷(hm5C)、1-甲基-假異胞嘧啶核苷、吡咯并-胞嘧啶核苷、吡咯并-假異胞嘧啶核苷、2-硫基-胞嘧啶核苷(s2C)、2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-硫基-假異胞嘧啶核苷、4-硫基-1-甲基-假異胞嘧啶核苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假異胞嘧啶核苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞嘧啶核苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶核苷、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-甲氧基-假異胞嘧啶核苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞嘧啶核苷、立西啶(k2C)、α-硫基-胞嘧啶核苷、2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m4Cm)、5-甲醯基-2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞嘧啶核苷(m42Cm)、1-硫基-胞嘧啶核苷、2’-F-阿糖-胞嘧啶核苷、2’-F-胞嘧啶核苷及2’-OH-阿糖-胞嘧啶核苷。 |
| [0344] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之腺嘌呤。具有經修飾之腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如，2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺苷、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘胺酸基胺甲醯基-腺苷(g6A)、 N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、8-疊氮基-腺苷、2’-F-阿糖-腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-阿糖-腺苷及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺苷。 |
| [0345] | 在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷丁苷(yW)、過氧基懷丁苷(o2yW)、羥基懷丁苷(OhyW)、未完全修飾之羥基懷丁苷(OhyW*)、7-去氮雜-鳥苷、Q核苷(Q)、環氧基Q核苷(oQ)、半乳糖基-Q核苷(galQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮雜-鳥苷、6-硫基-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷(m7G)、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基-鳥苷(m1G)、N2-甲基-鳥苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥苷(m22G)、N2,7-二甲基-鳥苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鳥苷(m2,2,7G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷、N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷、α-硫基-鳥苷、2'-O-甲基-鳥苷 (Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫基-鳥苷、O6-甲基-鳥苷、2’-F-阿糖-鳥苷及2’-F-鳥苷。 |
| [0346] | N連接醣基化位點突變體 |
| [0347] | 病毒蛋白之N連接聚糖在調節免疫反應中具有重要作用。聚糖對於維持適當之抗原性構型、遮蔽潛在之中和抗原決定基可為重要的，且可改變蛋白之蛋白水解易感性。一些病毒具有推定之N連接醣基化位點。刪除或修飾N連接醣基化位點可增強免疫反應。因此，在一些實施例中，本發明提供包含編碼在一或多個N連接醣基化位點處包含刪除或修飾之抗原性多肽之核酸(例如，mRNA)的RNA(例如，mRNA)疫苗。 |
| [0348] | RNA(例如，mRNA)之活體外轉錄 |
| [0349] | 本發明之呼吸道病毒疫苗包含至少一種RNA聚核苷酸，諸如mRNA(例如，經修飾之mRNA)。例如，mRNA自模板DNA(稱為「活體外轉錄模板」)經活體外轉錄。在一些實施例中，活體外轉錄模板編碼5'非轉譯(UTR)區、含有開放閱讀框架且編碼3'UTR及聚腺苷酸尾。活體外轉錄模板之特定核酸序列組成及長度將取決於由該模板編碼之mRNA。 |
| [0350] | 「5'非轉譯區」(5'UTR)係指直接位於起始密碼子(亦即，由核糖體轉譯之mRNA轉錄物之第一密碼子)上游(亦即，5')之不編碼多肽之mRNA區域。 |
| [0351] | 「3'非轉譯區」(3'UTR)係指直接位於終止密碼子(亦即，指明轉譯終止之mRNA轉錄物之密碼子)下游(亦即，3')之不編碼多肽之mRNA區域。 |
| [0352] | 「開放閱讀框架」為由起始密碼子(例如，甲硫胺酸(ATG))開始且以終止密碼子(例如，TAA、TAG或TGA)結束之DNA連續延伸段且編碼多肽。 |
| [0353] | 「聚腺苷酸尾」為位於含有多個連續單磷酸腺苷之3' UTR下游，例如直接位於其下游(亦即3')之mRNA區域。聚腺苷酸尾可含有10至300個單磷酸腺苷。例如，聚腺苷酸尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個單磷酸腺苷。在一些實施例中，聚腺苷酸尾含有50至250個單磷酸腺苷。在一相關生物情境中(例如，在細胞中、活體內)，poly(A)尾用以保護mRNA以免酶促降解，例如在細胞質中，且有助於轉錄終止、自核輸出mRNA並轉譯。 |
| [0354] | 在一些實施例中，聚核苷酸包括200至3,000個核苷酸。例如，聚核苷酸可包括200至500個、200至1000個、200至1500個、200至3000個、500至1000個、500至1500個、500至2000個、500至3000個、1000至1500個、1000至2000個、1000至3000個、1500至3000個或2000至3000個核苷酸。 |
| [0355] | 鞭毛蛋白佐劑 |
| [0356] | 鞭毛蛋白為約500個胺基酸之單體蛋白，其聚合形成與細菌運動相關之鞭毛。鞭毛蛋白由各種鞭毛形細菌(例如，鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium))以及非鞭毛形細菌(諸如大腸桿菌(Escherichia coli))來表現。由Toll樣受體5(TLR5)以及Nod樣受體(NLR)Ipaf及Naip5介導先天免疫系統細胞(樹突狀細胞、巨噬細胞等)對鞭毛蛋白之感測。已證實TLR及NLR在活化先天免疫反應及適應性免疫反應中具有重要作用。因此，鞭毛蛋白在疫苗中 提供佐劑效應。 |
| [0357] | 編碼已知鞭毛蛋白多肽之核苷酸及胺基酸序列在NCBI GenBank資料庫中公開可得。尤其已知來自鼠傷寒沙氏桿菌(S.Typhimurium)、幽門螺旋桿菌(H.Pylori)、霍亂弧菌(V.Cholera)、黏質沙雷氏菌(S.marcesens)、痢疾志賀氏桿菌(S.flexneri)、梅毒螺旋菌(T.Pallidum)、嗜肺性退伍軍人桿菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋體菌(B.burgdorferei)、難治梭狀芽孢桿菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌農桿菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、克氏巴爾通體菌(B.clarridgeiae)、奇異變型桿菌(P.Mirabilis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilus)、李斯特單胞菌(L.monocytogenes)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)及大腸桿菌(E.coli)之鞭毛蛋白序列。 |
| [0358] | 如本文所用之鞭毛蛋白多肽係指全長鞭毛蛋白、其免疫原性片段及與鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50%序列一致性之肽。例示性鞭毛蛋白包括來自傷寒桿菌(Salmonella typhi)(UniPro輸入號：Q56086)、鼠傷寒沙氏桿菌(A0A0C9DG09)、腸炎沙氏桿菌(Salmonella enteritidis)(A0A0C9BAB7)及豬瘟沙氏桿菌(Salmonella choleraesuis)(Q6V2X8)及SEQ ID NO：54至56(表17)之鞭毛蛋白。在一些實施例中，鞭毛蛋白多肽與鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%或99%之序列一致性。 |
| [0359] | 在一些實施例中，鞭毛蛋白多肽為免疫原性片段。免疫原性片段為引起免疫反應之鞭毛蛋白部分。在一些實施例中，免疫反應為TLR5免疫反應。免疫原性片段之一種實例為其中所有或一部分鉸鏈區已刪除或由其他胺基酸置換之鞭毛蛋白。例如，抗原性多肽可插入鉸鏈區中。鉸鏈區為鞭毛蛋白之高變區。鞭毛蛋白之 鉸鏈區亦稱為「D3結構域或D3區」、「推進結構域或推進區」、「高變結構域或高變區」及「可變結構域或可變區」。如本文所用，「至少一部分鉸鏈區」係指鞭毛蛋白鉸鏈區之任何部分或整個鉸鏈區。在其他實施例中，鞭毛蛋白之免疫原性片段為鞭毛蛋白之20、25、30、35或40個胺基酸C末端片段。 |
| [0360] | 鞭毛蛋白單體由結構域D0至D3形成。形成主幹之D0及D1由串聯長α螺旋體組成且在不同細菌間高度保守。D1結構域包括若干個適用於TLR5活化之胺基酸延伸段。整個D1結構域或結構域中之一或多個活化區為鞭毛蛋白之免疫原性片段。D1結構域中之免疫原性區之實例包括殘基88至114及殘基411至431(在鼠傷寒沙氏桿菌F1iC鞭毛蛋白中)。在88至100區中之13個胺基酸內，在沙氏桿菌鞭毛蛋白與仍保持TLR5活化之其他鞭毛蛋白之間至少允許6次取代。因此，鞭毛蛋白之免疫原性片段包括活化TLR5且含有與FliC之88至100中之沙氏桿菌序列(LQRVRELAVQSAN；SEQ ID NO：84)53%或更大一致之13個胺基酸基序的鞭毛蛋白樣序列。 |
| [0361] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括編碼鞭毛蛋白與一或多種抗原性多肽之融合蛋白的RNA。如本文所用之「融合蛋白」係指構築體之兩種組分的連接。在一些實施例中，抗原性多肽之羧基末端與鞭毛蛋白多肽之胺基末端融合或連接。在其他實施例中，抗原性多肽之胺基末端與鞭毛蛋白多肽之羧基末端融合或連接。融合蛋白可包括例如與一種、兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上抗原性多肽連接之一種、兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上鞭毛蛋白多肽。當兩種或兩種以上鞭毛蛋白多肽及/或兩種或兩種以上抗原性多肽連接時，該種構築體可稱為「多聚體」。 |
| [0362] | 融合蛋白之每種組分可直接彼此連接或其可經由連接子連 接。舉例而言，連接子可為胺基酸連接子。由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼連接融合蛋白之組分的胺基酸連接子可包括例如選自由以下組成之群之至少一個成員：離胺酸殘基、麩胺酸殘基、絲胺酸殘基及精胺酸殘基。在一些實施例中，連接子長度為1至30、1至25、1至25、5至10、5、15或5至20個胺基酸。 |
| [0363] | 在其他實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括至少兩種獨立之RNA聚核苷酸，一種編碼一或多種抗原性多肽且另一種編碼鞭毛蛋白多肽。該至少兩種RNA聚核苷酸可在諸如脂質奈米粒子之載劑中共同調配。 |
| [0364] | 廣效RNA(例如，mRNA)疫苗 |
| [0365] | 可存在人具有感染hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之一種以上菌株之風險的情形。RNA(例如，mRNA)治療性疫苗由於多種因素而尤其符合組合疫苗接種方法，該等因素包括(但不限於)製造速度、快速調整疫苗以適應感知地理威脅之能力及其類似因素。此外，由於疫苗利用人體來產生抗原性蛋白，因此該等疫苗符合生產更大、更複雜之抗原性蛋白，從而允許在人類個體中適當摺疊、表面表現、抗原呈現等。為針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之一種以上菌株進行保護，可投與組合疫苗，該組合疫苗包括編碼第一呼吸道病毒之至少一種抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)之RNA(例如，mRNA)且進一步包括編碼第二呼吸道病毒之至少一種抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)之RNA。RNA(例如，mRNA)可例如在單一脂質奈米粒子(LNP)中共同調配，或可在單 獨LNP中經調配以用於共同投藥。 |
| [0366] | 治療方法 |
| [0367] | 本文提供用於在人類及其他哺乳動物體內預防及/或治療呼吸道疾病/感染之組合物(例如，醫藥組合物)、方法、套組及試劑。呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可單獨或與其他疫苗組合用作治療劑或預防劑。其可用於藥物中來預防及/或治療呼吸道疾病/感染。在例示性態樣中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗用於提供來自hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之預防性保護作用。在投與本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗後可達成來自hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之預防性保護作用。本發明之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可用於治療或預防含有兩種或兩種以上呼吸道感染之病毒「共同感染」。疫苗可投與一次、兩次、三次、四次或四次以上，但可能投與一次疫苗(視情況緊接單次補強劑)即足夠。儘管較不有利，但可能向受感染個體投與疫苗來達成治療性反應。給藥可需要相應調整。 |
| [0368] | 本發明之態樣中提供一種在個體中引發針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之免疫反應的方法。該方法涵蓋向個體投與呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV- NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，由此在個體中誘發對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加。「抗-抗原性多肽抗體」為特異性地結合抗原性多肽之血清抗體。 |
| [0369] | 在一些實施例中，能夠引發免疫反應之RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1 RNA疫苗)經由包括根據式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)化合物(例如，化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112或122)之組合物經肌肉內投與。 |
| [0370] | 預防有效劑量為以臨床上可接受之水準預防病毒感染之治療有效劑量。在一些實施例中，治療有效劑量為疫苗之包裝插頁中所列之劑量。如本文所用，傳統疫苗係指除本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗以外之疫苗。舉例而言，傳統疫苗包括(但不限於)活/減毒微生物疫苗、死/不活化微生物疫苗、次單位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗等。在例示性實施例中，傳統疫苗為已實現註冊審批及/或已由國家藥品監督管理機構(例如， 美國食品與藥品管理局(the Food and Drug Administration，FDA)或歐洲藥品管理局(the European Medicines Agency，EMA))註冊之疫苗。 |
| [0371] | 在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加了1 log至10 log。 |
| [0372] | 在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加了1 log、2 log、3 log、5 log或10 log。 |
| [0373] | 本發明之其他態樣中提供一種在個體中引發針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之免疫反應的方法。該方法涵蓋向個體投與呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，由此在個體中誘發對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、 HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之免疫反應等同於在以相對於RNA(例如，mRNA)疫苗而言2倍至100倍劑量水準之針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中的免疫反應。 |
| [0374] | 在一些實施例中，個體中之免疫反應等同於在經傳統疫苗以相對於hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)RNA(例如，mRNA)疫苗而言2、3、4、5、10、50、100倍之劑量水準進行疫苗接種之個體中之免疫反應。 |
| [0375] | 在一些實施例中，個體中之免疫反應等同於在經傳統疫苗以相對於hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)RNA(例如，mRNA)疫苗而言10至100倍或100至1000倍之劑量水準進行疫苗接種之個體中之免疫反應。 |
| [0376] | 在一些實施例中，藉由測定個體中之[蛋白]抗體效價來評估免疫反應。 |
| [0377] | 本發明之一些態樣提供一種在個體中針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)引發免疫反應之方法。在一些實施例中，個體中之免疫反應等同於在經傳統疫苗以相對於hMPV、PIV3、RSV、 MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)RNA(例如，mRNA)疫苗而言2、3、4、5、10、50、100倍之劑量水準進行疫苗接種之個體中的免疫反應，藉由向個體投與呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，由此在個體中誘發對抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之免疫反應相對於在經預防有效劑量之針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早2天至10週誘發。在一些實施例中，個體中之免疫反應係在經預防有效劑量之傳統疫苗以相對於RNA(例如，mRNA)疫苗而言2倍至100倍之劑量水準進行疫苗接種之個體中誘發。 |
| [0378] | 在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早2天或早3天誘發。 |
| [0379] | 在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早1週、2週、3週、5週或10週誘發。 |
| [0380] | 本文亦提供一種藉由向個體投與具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗而在個體中引發針對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS- CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之免疫反應的方法，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且其中佐劑不與疫苗共同調配或共同投藥。 |
| [0381] | 治療性及預防性組合物 |
| [0382] | 本文提供用於例如在人類及其他哺乳動物中預防、治療或診斷hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)之組合物(例如，醫藥組合物)、方法、套組及試劑。呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可用作治療劑或預防劑。其可用於藥物中以預防及/或治療傳染病。在一些實施例中，本發明之呼吸道RNA(例如，mRNA)疫苗用於啟動免疫效應細胞，例如用於離體活化外周血液單核細胞(PBMC)，其隨後經注入(再注入)個體中。 |
| [0383] | 在一些實施例中，可將如本文所述含有RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之呼吸道病毒疫苗投與個體(例如，哺乳動物個體，諸如人類個體)，且RNA(例如，mRNA)聚核苷酸經活體內轉譯以產生抗原性多肽。 |
| [0384] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可經誘發用於在細胞、組織或有機體中轉譯多肽(例如，抗原或免疫原)。在一些實施例中，該轉譯在活體內發生，但仍可離體、在培養物中或在活體外發生該轉譯。在一些實施例中，使細胞、組織或有機體與有效量之含有呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之組合物相接觸，該疫苗含有具有至少一個編碼抗原性多肽之可轉譯區的聚核苷酸。 |
| [0385] | 「有效量」之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗係至少部分地基於標靶組織、標靶細胞類型、投藥方式、聚核苷酸之物理 特徵(例如，經修飾核苷之大小及程度)及疫苗之其他組分及其他決定因素來提供。一般而言，有效量之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物提供隨細胞中之抗原產量而變化之引發或補強免疫反應，較佳比含有編碼相同抗原或肽抗原之相應未經修飾聚核苷酸之組合物更為有效。抗原產量增加可由細胞轉染增加(經RNA(例如，mRNA)疫苗轉染之細胞之百分比)、自聚核苷酸之蛋白轉譯增加、核酸降解減少(例如，由自經修飾之聚核苷酸進行蛋白轉譯之持續時間增加證實)或宿主細胞之抗原特異性免疫反應改變而得以證實。 |
| [0386] | 在一些實施例中，根據本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗(包括聚核苷酸及其編碼多肽)可用於治療hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV(包括MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH及/或HCoV-HKU1)。 |
| [0387] | 呼吸道RNA(例如，mRNA)疫苗可作為主動免疫流程之部分預防性或治療性地投與至健康個體或在症狀發作後在培育期或主動感染期之感染早期投與。在一些實施例中，提供給細胞、組織或個體的本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗之量可為對於免疫預防而言有效之量。 |
| [0388] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可與其他預防性或治療性化合物一起投與。作為一非限制性實例，預防性或治療性化合物可為佐劑或補強劑。如本文所用，當提及預防性組合物(諸如疫苗)時，術語「補強劑」係指額外投與之預防性(疫苗)組合物。補強劑(或補強疫苗)可在早期投與預防性組合物之後給予。初始投與預防性組合物與補強劑之間之投藥時間可為(但不限於)1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分 鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、36小時、2天、3天、4天、5天、6天、1週、10天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、18個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在一些實施例中，初始投與預防性組合物與補強劑之間之投藥時間可為(但不限於)1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、6個月或1年。 |
| [0389] | 在一些實施例中，類似於此項技術中已知之投與不活化疫苗，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可經肌肉內或皮內投與。 |
| [0390] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗視感染之盛行率或未滿足醫學需要之程度或水準而可用於各種情境中。作為一非限制性實例，RNA(例如，mRNA)疫苗可用於治療及/或預防各種呼吸道感染。RNA(例如，mRNA)疫苗之優越特性在於其與市售之抗病毒劑/組合物相比產生大得多之抗體效價且比市售之抗病毒劑/組合物早地產生反應。 |
| [0391] | 本文提供醫藥組合物，其包括呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗及視情況與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合之RNA(例如，mRNA)疫苗組合物及/或複合物。 |
| [0392] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可單獨或與一或多種其 他組分結合進行調配或投與。舉例而言，hMPV/PIV3/RSV RNA(例如，mRNA)疫苗(疫苗組合物)可包含其他組分，包括(但不限於)佐劑。 |
| [0393] | 在一些實施例中，呼吸道病毒(例如，mRNA)疫苗不包括佐劑(其不含佐劑)。 |
| [0394] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合進行調配或投與。在一些實施例中，疫苗組合物包含至少一種其他活性物質，諸如治療活性物質、預防活性物質或兩者之組合。疫苗組合物可為無菌的、不含熱原或無菌且不含熱原。醫藥劑(諸如疫苗組合物)之調配及/或製造中之一般考慮因素可見於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams & Wilkins,2005(其以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0395] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗經投與至人類、人類患者或個體。為本發明之目的，片語「活性成分」通常係指RNA(例如，mRNA)疫苗或其中所含之聚核苷酸，例如編碼抗原性多肽之RNA聚核苷酸(例如，mRNA聚核苷酸)。 |
| [0396] | 本文所述之呼吸道病毒疫苗組合物之調配物可藉由已知或後來在藥理學技術中研發之任何方法來製備。一般而言，該等製備方法包括以下步驟：使活性成分(例如，mRNA聚核苷酸)與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分結合，且隨後若必要及/或需要，將產物分份、成形及/或封裝成所需之單劑量或多劑量單位。 |
| [0397] | 根據本發明，醫藥組合物中之活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量將視受治療個體之特性、體型及/或病況且進一步視將投與組合物之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與100%之間，例如0.5與50%之間、1至30%之 間、5至80%之間、至少80%(w/w)之活性成分。 |
| [0398] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可使用一或多種賦形劑來調配以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染；(3)允許持續或延遲釋放(例如，來自儲存調配物)；(4)改變生物分佈(例如，靶向特異性組織或細胞類型)；(5)增加編碼蛋白之活體內轉譯；及/或(6)改變編碼蛋白(抗原)之活體內釋放概況。除了傳統賦形劑(諸如任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑)以外，分散液或懸浮液助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、賦形劑可包括(不限於)類脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂複合體、核殼奈米粒子、肽、蛋白、經呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗轉染之細胞(例如，用於移植至個體中)、玻尿酸酶、奈米粒子模擬物及其組合。 |
| [0399] | 穩定化元件 |
| [0400] | 已發現天然產生之真核mRNA分子除了諸如5'-端帽結構或3'-poly(A)尾之其他結構特徵以外還含有穩定化元件，包括(但不限於)位於其5'-末端之非轉譯區(UTR)(5'UTR)及/或位於其3'-末端之非轉譯區(UTR)(3'UTR)。5'UTR與3'UTR兩者通常均由基因組DNA轉錄且為未成熟mRNA之元件。通常在mRNA加工期間向轉錄(未成熟)mRNA中增加成熟mRNA之特徵性結構特徵，諸如5'-端帽及3'-poly(A)尾。3'-poly(A)尾通常為增加至轉錄mRNA之3'-末端之腺嘌呤核苷酸的延伸段。其可包含多達約400個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，3'-poly(A)尾之長度可為相對於個別mRNA之穩定性而言之必需元件。 |
| [0401] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可包括一或多種穩定化元件。穩定化元件例如可包括組蛋白莖環。已識別莖環結合蛋白(SLBP)，其係一種32kDa蛋白。其與位於核及細胞質中之 組蛋白信使之3'-末端的組蛋白莖環相關。其表現水準由細胞週期來調節；其在S階段期間達到峯值，此時組蛋白mRNA水準亦升高。已證實由U7 snRNP對組蛋白pre-mRNA之3'-末端進行有效加工必需蛋白。SLBP在加工後繼續與莖環結合，且隨後刺激成熟組蛋白mRNA在細胞質中轉譯為組蛋白。SLBP之RNA結合域在後生動物及原生動物中係保守的；其與組蛋白莖環之結合取決於環之結構。最小結合位點相對於莖環而言包括至少三個核苷酸5'及兩個核苷酸3'。 |
| [0402] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括一編碼區、至少一個組蛋白莖環及視情況一poly(A)序列或多腺苷酸化信號。poly(A)序列或多腺苷酸化信號通常應增強編碼蛋白之表現水準。在一些實施例中，編碼蛋白並非組蛋白、報導體蛋白(例如，螢光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或標記或選擇蛋白(例如，α-血球蛋白、半乳糖激酶及黃嘌呤：鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(GPT))。 |
| [0403] | 在一些實施例中，poly(A)序列或多腺苷酸化信號與至少一種組蛋白莖環之組合儘管實際上代表替代機制，但仍協同作用以增加蛋白表現超越由任一個別元件所觀測之水準。已發現，poly(A)與至少一種組蛋白莖環之組合的協同效應並不取決於元件之次序或poly(A)序列之長度。 |
| [0404] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗不包含組蛋白下游元件(HDE)。「組蛋白下游元件」(HDE)包括天然產生莖環之約15至20個核苷酸3'的富含嘌呤之聚核苷酸延伸段，代表U7 snRNA之結合位點，其在將組蛋白pre-mRNA加工為成熟組蛋白mRNA中有所涉及。實際上，本發明之核酸不包括內含子。 |
| [0405] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可含有或可不含 增強子及/或啟動子序列，其可經修飾或未經修飾或可為活化或未活化的。在一些實施例中，組蛋白莖環通常源自組蛋白基因，且包括由間隔基分開、包括短序列(例如，由短序列組成)之兩個相鄰的部分或完全相反之互補序列之分子內鹼基配對，其形成該結構之環。非配對環區域通常無法與莖環元件之任一者鹼基配對。其更常發生在RNA中，因其係多種RNA二級結構之重要組分，但亦可存在於單股DNA中。莖環結構之穩定性通常取決於錯配或凸起之長度、數量以及配對區域之鹼基組成。在一些實施例中，可產生不穩定之鹼基配對(非Watson-Crick鹼基配對)。在一些實施例中，該至少一種組蛋白莖環序列包含15至45個核苷酸之長度。 |
| [0406] | 在其他實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可移除一或多個富含AU之序列。該等序列(有時稱為AURES)係在3’UTR中發現之去穩定化序列。AURES可自RNA(例如，mRNA)疫苗移除。或者，AURES可保留在RNA(例如，mRNA)疫苗中。 |
| [0407] | 奈米粒子調配物 |
| [0408] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在奈米粒子中調配。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在脂質奈米粒子中調配。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在脂質-聚陽離子複合物(稱為陽離子脂質奈米粒子)中調配。作為一非限制性實例，聚陽離子可包括陽離子肽或多肽，諸如(但不限於)聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包括非陽離子脂質，諸如(但不限於)膽固醇或二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。 |
| [0409] | 脂質奈米粒子調配物可受(但不限於)陽離子脂質組分之選擇、陽離子脂質之飽和程度、聚乙二醇化之性質、所有組分之比 率及生物物理學參數(諸如，尺寸)的影響。在Semple等人(Nature Biotech.201028：172-176)之一種實例中，脂質奈米粒子調配物可由57.1%陽離子脂質、7.1%二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼、34.3%膽固醇及1.4% PEG-c-DMA組成。另外舉例而言，改變陽離子脂質之組成可更有效地將siRNA傳遞至各種抗原呈現細胞(Basha等人Mol Ther.2011 19：2186-2200)。 |
| [0410] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物可包含35至45%陽離子脂質、40%至50%陽離子脂質、50%至60%陽離子脂質及/或55%至65%陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子中之脂質與RNA(例如，mRNA)之比率可為5：1至20：1、10：1至25：1、15：1至30：1及/或至少30：1。 |
| [0411] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物中PEG之比率可增加或減少，及/或PEG脂質之碳鏈長度可經修飾為C14至C18以改變脂質奈米粒子調配物之藥物動力學及/或生物分佈。作為一非限制性實例，與陽離子脂質、DSPC及膽固醇相比，脂質奈米粒子調配物可含有0.5%至3.0%、1.0%至3.5%、1.5%至4.0%、2.0%至4.5%、2.5%至5.0%及/或3.0%至6.0%之脂質莫耳比之PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)(本文中亦稱為PEG-DOMG)。在一些實施例中，PEG-c-DOMG可由PEG脂質替代，諸如(但不限於)PEG-DSG(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油)及/或PEG-DPG(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。陽離子脂質可選自此項技術中已知之任何脂質，諸如(但不限於)DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200及DLin-KC2-DMA。 |
| [0412] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗調配 物為包含至少一種脂質之奈米粒子。脂質可選自(但不限於)DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂質及胺基醇脂質。在一些實施例中，脂質可為陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA及胺基醇脂質。胺基醇陽離子脂質可為美國專利公開案第US20130150625號中所述及/或由其中所述之方法製得之脂質，該專利公開案以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，陽離子脂質可為2-胺基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,2Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物1)；2-胺基-3-[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物2)；2-胺基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中之化合物3)；及2-(二甲胺基)-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物4)；或其任何醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 |
| [0413] | 脂質奈米粒子調配物通常包含脂質，特定而言為可電離之陽離子脂質，例如2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，且進一步包含中性脂質、固醇及能夠減少粒子凝集之分子，例如PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0414] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由以下組成：(i)至少一種選自由以下各物組成之群之脂質：2,2-二亞油基-4-二 甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)；(ii)選自DSPC、DPPC、POPC、DOPE及SM之中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)PEG-脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其莫耳比為20至60%之陽離子脂質：5至25%之中性脂質：25至55%之固醇；0.5至15%之PEG-脂質。 |
| [0415] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括25%至75%之選自以下之陽離子脂質：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，例如基於莫耳濃度計35至65%、45至65%、60%、57.5%、50%或40%。 |
| [0416] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括0.5%至15%之中性脂質，例如基於莫耳濃度計3至12%、5至10%或15%、10%或7.5%。中性脂質之實例包括(不限於)DSPC、POPC、DPPC、DOPE及SM。在一些實施例中，調配物基於莫耳濃度計包括5%至50%之固醇(例如，基於莫耳濃度計15至45%、20至40%、40%、38.5%、35%或31%)。固醇之一非限制性實例為膽固醇。在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括0.5%至20%之PEG或經PEG改質之脂質(例如，基於莫耳濃度計0.5至10%、0.5至5%、1.5%、0.5%、1.5%、3.5%或5%)。在一些實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量為2,000Da之PEG分子。在一些實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量小於2,000，例如約1,500Da、約1,000Da或約500Da之PEG分子。經PEG改質之脂質之非限制性實例包括PEG-二硬脂醯 基甘油(PEG-DMG)(本文中亦稱為PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人，J.Controlled Release,107,276-287(2005)中進一步論述，其內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0417] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括25至75%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、0.5至15%之中性脂質、5至50%之固醇及0.5至20%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0418] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括35至65%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、3至12%之中性脂質、15至45%之固醇及0.5至10%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0419] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括45至65%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、5至10%之中性脂質、25至40%之固醇及0.5至10%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0420] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括60%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、7.5%之中性脂質、31%之固醇及1.5%之 PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0421] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括50%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、10%之中性脂質、38.5%之固醇及1.5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0422] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括50%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、10%之中性脂質、35%之固醇、4.5%或5%之PEG或經PEG改質之脂質及0.5%之標靶脂質。 |
| [0423] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括40%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、15%之中性脂質、40%之固醇及5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0424] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括57.2%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、7.1%之中性脂質、34.3%之固醇及1.4%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0425] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基於莫耳濃度計包括 57.5%之陽離子脂質(選自PEG脂質，其為PEG-cDMA，PEG-cDMA在Reyes等人(J.Controlled Release,107,276-287(2005))中進一步論述，其內容以全文引用之方式併入本文中)、7.5%之中性脂質、31.5%之固醇及3.5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0426] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由莫耳比為20至70%陽離子脂質：5至45%中性脂質：20至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質之脂質混合物組成。在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由莫耳比為20至60%陽離子脂質：5至25%中性脂質：25至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質之脂質混合物組成。 |
| [0427] | 在一些實施例中，脂質之莫耳比為50/10/38.5/1.5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DPPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DSG)、50/10/35/5(陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。 |
| [0428] | 脂質奈米粒子組合物及其製備方法之非限制性實例例如在 Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等人(2012),Angew.Chem.Int.編，51：8529-8533；及Maier等人(2013)Molecular Therapy 21,1570-1578(其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)中描述。 |
| [0429] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物可包含陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質且視情況包含非陽離子脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含40至60%之陽離子脂質、5至15%之非陽離子脂質、1至2%之PEG脂質及30至50%之結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含50%之陽離子脂質、10%之非陽離子脂質、1.5%之PEG脂質及38.5%之結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含55%之陽離子脂質、10%之非陽離子脂質、2.5%之PEG脂質及32.5%之結構脂質。在一些實施例中，陽離子脂質可為本文所述之任何陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及L319。 |
| [0430] | 在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可為4組分脂質奈米粒子。脂質奈米粒子可包含陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含40至60%之陽離子脂質、5至15%之非陽離子脂質、1至2%之PEG脂質及30至50%之結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含50%之陽離子脂質、10%之非陽離子脂質、1.5%之PEG脂質及38.5%之結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含55%之陽離子脂質、10%之非陽離子脂質、2.5%之PEG脂質及32.5%之結構脂質。在一些實施例中，陽離子脂質可為本文所述之任何陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及L319。 |
| [0431] | 在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可包含陽 離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%之陽離子脂質DLin-KC2-DMA、10%之非陽離子脂質DSPC、1.5%之PEG脂質PEG-DOMG及38.5%之結構脂質膽固醇。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%之陽離子脂質DLin-MC3-DMA、10%之非陽離子脂質DSPC、1.5%之PEG脂質PEG-DOMG及38.5%之結構脂質膽固醇。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%之陽離子脂質DLin-MC3-DMA、10%之非陽離子脂質DSPC、1.5%之PEG脂質PEG-DMG及38.5%之結構脂質膽固醇。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子包含55%之陽離子脂質L319、10%之非陽離子脂質DSPC、2.5%之PEG脂質PEG-DMG及32.5%之結構脂質膽固醇。 |
| [0432] | 疫苗組合物中之活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量可視受治療個體之特性、體型及/或病況且進一步視將投與組合物之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與99%(w/w)之間之活性成分。舉例而言，組合物可包含0.1%與100%之間，例如.5與50%之間、1至30%之間、5至80%之間、至少80%(w/w)之活性成分。 |
| [0433] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可包含調配在包含MC3、膽固醇、DSPC及PEG2000-DMG之脂質奈米粒子中之本文所述之聚核苷酸、緩衝液檸檬酸三鈉、蔗糖及注射用水。作為一非限制性實例，組合物包含：2.0mg/mL之藥物物質(例如，編碼H10N8 hMPV之聚核苷酸)、21.8mg/mL之MC3、10.1mg/mL之膽固醇、5.4mg/mL之DSPC、2.7mg/mL之PEG2000-DMG、5.16mg/mL之檸檬酸三鈉、71mg/mL之蔗糖及1.0mL之注射用水。 |
| [0434] | 在一些實施例中，奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)具有10至 500nm、20至400nm、30至300nm、40至200nm之平均直徑。在一些實施例中，奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)具有50至150nm、50至200nm、80至100nm或80至200nm之平均直徑。 |
| [0435] | 脂質體、脂複合體及脂質奈米粒子 |
| [0436] | 本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可使用一或多種脂質體、脂複合體或脂質奈米粒子來調配。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之醫藥組合物包括脂質體。脂質體為可主要由脂質雙層組成之人工製備微脂粒且可用作用於投與營養素及醫藥調配物之傳遞媒劑。脂質體可具有不同大小，諸如(但不限於)直徑可為數百奈米且可含有一系列由窄的含水隔室分開之同心雙層的多層微脂粒(MLV)、直徑可小於50nm之小的單層微脂粒(SUV)及直徑可在50與500nm之間之大的單層微脂粒(LUV)。脂質體設計可包括(但不限於)調理素或配位體以改良脂質體與不健康組織之附著或活化事件，諸如(但不限於)細胞吞噬。脂質體可含有低或高pH值以改良醫藥調配物之傳遞。 |
| [0437] | 脂質體之形成可取決於物理化學特徵，諸如(但不限於)截留之醫藥調配物及脂質體成分、脂質微脂粒分散於其中之介質之性質、截留物質之有效濃度及其潛在毒性、在應用期間涉及之任何其他過程及/或微脂粒之傳遞、微脂粒用於預期應用之最佳大小、多分散性及存放期及大規模生產安全且有效之脂質體產物的各批次之間之再現性及可能性。 |
| [0438] | 在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可包括(不限於)諸如由1,2-二油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DODMA)脂質體形成之彼等脂質體、來自Marina Biotech(Bothell,WA)之DiLa2脂質體、1,2-二亞油基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)及MC3 (US20100324120；其以全文引用之方式併入本文中)及可傳遞小分子藥物之脂質體，諸如(但不限於)來自Janssen Biotech,Inc.(Horsham,PA)之DOXIL®。 |
| [0439] | 在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可包括(不限於)諸如由合成先前所述且展示適合活體外及活體內傳遞寡核苷酸之穩定化質體-脂質粒子(SPLP)或穩定化核酸脂質粒子(SNALP)所形成之彼等脂質體(參見Wheeler等人Gene Therapy.1999 6：271-281；Zhang等人Gene Therapy.1999 6：1438-1447；Jeffs等人Pharm Res.2005 22：362-372；Morrissey等人，Nat Biotechnol.2005 2：1002-1007；Zimmermann等人，Nature.2006 441：111-114；Heyes等人J Contr Rel.2005 107：276-287；Semple等人Nature Biotech.2010 28：172-176；Judge等人J Clin Invest.2009 119：661-673；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132；美國專利公開案第US20130122104號；其全部以全文併入本文中)。Wheeler等人最初之製造方法為清潔劑透析方法，其後來由Jeffs等人改良且稱為自發微脂粒形成方法。除聚核苷酸以外，脂質體調配物由3至4種脂質組分組成。舉例而言，如Jeffs等人所述，脂質體可含有(但不限於)55%之膽固醇、20%之二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、10%之PEG-S-DSG及15%之1,2-二油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DODMA)。另外舉例而言，如Heyes等人所述，某些脂質體調配物可含有(但不限於)48%之膽固醇、20%之DSPC、2%之PEG-c-DMA及30%之陽離子脂質，其中陽離子脂質可為1,2-二硬脂醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亞油烯基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLenDMA)。 |
| [0440] | 在一些實施例中，脂質體調配物可包含約25.0%膽固醇至約40.0%膽固醇、約30.0%膽固醇至約45.0%膽固醇、約35.0%膽固醇 至約50.0%膽固醇及/或約48.5%膽固醇至約60%膽固醇。在一些實施例中，調配物可包含選自由以下組成之群之膽固醇百分比：28.5%、31.5%、33.5%、36.5%、37.0%、38.5%、39.0%及43.5%。在一些實施例中，調配物可包含約5.0%至約10.0%之DSPC及/或約7.0%至約15.0%之DSPC。 |
| [0441] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗醫藥組合物可在脂質體中調配，該等脂質體諸如(但不限於)DiLa2脂質體(Marina Biotech,Bothell,WA)、SMARTICLES®(Marina Biotech,Bothell,WA)、基於中性DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼)之脂質體(例如，siRNA傳遞用於卵巢癌(Landen等人Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)；其以全文引用之方式併入本文中)及塗有玻尿酸之脂質體(Quiet Therapeutics,Israel)。 |
| [0442] | 在一些實施例中，陽離子脂質可為諸如美國專利申請案第20130090372號中所述之彼等低分子量陽離子脂質，該專利申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0443] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂質微脂粒中調配，該脂質微脂粒可在官能基化之脂質雙層之間具有交聯。 |
| [0444] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂質-聚陽離子複合物中調配。脂質-聚陽離子複合物之形成可由此項技術中已知及/或如美國公開案第20120178702號中所述之方法來實現，該公開案以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，聚陽離子可包括陽離子肽或多肽，諸如(但不限於)聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂質-聚陽離子複合物中調配，該複合物可進一步包括非陽離子脂質，諸如(但不限於)膽固醇或二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。 |
| [0445] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子(LNP)調配物中PEG之比率可增加或減小，及/或PEG脂質之碳鏈長度可經修飾為C14至C18以改變LNP調配物之藥物動力學及/或生物分佈。作為一非限制性實例，與陽離子脂質、DSPC及膽固醇相比，LNP調配物可含有約0.5%至約3.0%、約1.0%至約3.5%、約1.5%至約4.0%、約2.0%至約4.5%、約2.5%至約5.0%及/或約3.0%至約6.0%之脂質莫耳比之PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)(本文中亦稱為PEG-DOMG)。在一些實施例中，PEG-c-DOMG可由PEG脂質替代，諸如(但不限於)PEG-DSG(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油)及/或PEG-DPG(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。陽離子脂質可選自此項技術中已知之任何脂質，諸如(但不限於)DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200及DLin-KC2-DMA。 |
| [0446] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂質奈米粒子中調配。 |
| [0447] | 在一些實施例中，包含聚核苷酸之RNA(例如，mRNA)疫苗調配物為可包含至少一種脂質之奈米粒子。脂質可選自(但不限於)DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂質及胺基醇脂質。在另一態樣中，脂質可為陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA及胺基醇脂質。胺基醇陽離子脂質可為美國專利公開案第US20130150625號中所述及/或由其中所述之方法製得之脂質，該專利公開案以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，陽離子脂質可為2-胺基-3- [(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,2Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物1)；2-胺基-3-[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物2)；2-胺基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中之化合物3)；及2-(二甲胺基)-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物4)；或其任何醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 |
| [0448] | 脂質奈米粒子調配物通常包含脂質，特定而言為可電離之陽離子脂質，例如2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，且進一步包含中性脂質、固醇及能夠減少粒子凝集之分子，例如PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0449] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由以下組成：(i)至少一種選自由以下組成之群之脂質：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)；(ii)選自DSPC、DPPC、POPC、DOPE及SM之中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)PEG-脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其莫耳比為約20至60%之陽離子脂質：5至25%之中性脂質：25至55%之固醇；0.5至15%之PEG-脂質。 |
| [0450] | 在一些實施例中，調配物基於莫耳濃度計包括約25%至約75%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin- KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質，例如基於莫耳濃度計約35至約65%、約45至約65%、約60%、約57.5%、約50%或約40%。 |
| [0451] | 在一些實施例中，調配物基於莫耳濃度計包括約0.5%至約15%之中性脂質，例如基於莫耳濃度計約3至約12%、約5至約10%或約15%、約10%或約7.5%。中性脂質之實例包括(但不限於)DSPC、POPC、DPPC、DOPE及SM。在一些實施例中，調配物基於莫耳濃度計包括約5%至約50%之固醇(例如基於莫耳濃度計約15至約45%、約20至約40%、約40%、約38.5%、約35%或約31%)。一種例示性固醇為膽固醇。在一些實施例中，調配物基於莫耳濃度計包括約0.5%至約20%之PEG或經PEG改質之脂質(例如基於莫耳濃度計約0.5至約10%、約0.5至約5%、約1.5%、約0.5%、約1.5%、約3.5%或約5%)。在一些實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量為2,000Da之PEG分子。在其他實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量小於2,000、例如約1,500Da、約1,000Da或約500Da之PEG分子。經PEG改質之脂質之實例包括(但不限於)PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DMG)(本文中亦稱為PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人，J.Controlled Release,107,276-287(2005)中進一步論述，其內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0452] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括25至75%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、0.5至15%之中性脂質、5至50%之固醇及 0.5至20%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0453] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括35至65%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、3至12%之中性脂質、15至45%之固醇及0.5至10%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0454] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括45至65%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、5至10%之中性脂質、25至40%之固醇及0.5至10%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0455] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約60%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、約7.5%之中性脂質、約31%之固醇及約1.5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0456] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約50%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、約10%之中性脂質、約38.5%之固醇及約1.5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0457] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約 50%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、約10%之中性脂質、約35%之固醇、約4.5%或約5%之PEG或經PEG改質之脂質及約0.5%之標靶脂質。 |
| [0458] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約40%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、約15%之中性脂質、約40%之固醇及約5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0459] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約57.2%之選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)之陽離子脂質、約7.1%之中性脂質、約34.3%之固醇及約1.4%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0460] | 在一些實施例中，本發明之調配物基於莫耳濃度計包括約57.5%之陽離子脂質(選自PEG脂質，其為PEG-cDMA，PEG-cDMA在Reyes等人(J.Controlled Release,107,276-287(2005))中進一步論述，其內容以全文引用之方式併入本文中)、約7.5%之中性脂質、約31.5%之固醇及約3.5%之PEG或經PEG改質之脂質。 |
| [0461] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由莫耳比為20至70%陽離子脂質：5至45%中性脂質：20至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質；更佳莫耳比為約20至60%陽離子脂質：5至25%中性脂質：25至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質之脂質混合物 組成。 |
| [0462] | 在一些實施例中，脂質之莫耳比為50/10/38.5/1.5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DPPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DSG)、50/10/35/5(陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol%陽離子脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。 |
| [0463] | 脂質奈米粒子組合物及其製備方法之實例例如在Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等人(2012),Angew.Chem.Int.編，51：8529-8533；及Maier等人(2013)Molecular Therapy 21,1570-1578(其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)中描述。 |
| [0464] | 在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可包含陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質且視情況包含非陽離子脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約40至60%之陽離子脂質、約5至15%之非陽離子脂質、約1至2%之PEG脂質及約30-50%之結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約 50%之陽離子脂質、約10%之非陽離子脂質、約1.5%之PEG脂質及約38.5%之結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約55%之陽離子脂質、約10%之非陽離子脂質、約2.5%之PEG脂質及約32.5%之結構脂質。在一些實施例中，陽離子脂質可為本文所述之任何陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及L319。 |
| [0465] | 在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可為4組分脂質奈米粒子。脂質奈米粒子可包含陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約40-60%之陽離子脂質、約5至15%之非陽離子脂質、約1至2%之PEG脂質及約30-50%之結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約50%之陽離子脂質、約10%之非陽離子脂質、約1.5%之PEG脂質及約38.5%之結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含約55%之陽離子脂質、約10%之非陽離子脂質、約2.5%之PEG脂質及約32.5%之結構脂質。在一些實施例中，陽離子脂質可為本文所述之任何陽離子脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及L319。 |
| [0466] | 在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可包含陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含約50%之陽離子脂質DLin-KC2-DMA、約10%之非陽離子脂質DSPC、約1.5%之PEG脂質PEG-DOMG及約38.5%之結構脂質膽固醇。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含約50%之陽離子脂質DLin-MC3-DMA、約10%之非陽離子脂質DSPC、約1.5%之PEG脂質PEG-DOMG及約38.5%之結構脂質膽固醇。作為一非限制性實例，脂質奈米粒子包含約50%之陽離子脂質DLin-MC3-DMA、約10%之非陽離子脂質 DSPC、約1.5%之PEG脂質PEG-DMG及約38.5%之結構脂質膽固醇。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子包含約55%之陽離子脂質L319、約10%之非陽離子脂質DSPC、約2.5%之PEG脂質PEG-DMG及約32.5%之結構脂質膽固醇。 |
| [0467] | 作為一非限制性實例，陽離子脂質可選自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九烷-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六烷-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五烷-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二烷-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一烷-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三烷-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四烷-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七烷-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四烷-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三烷-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八烷-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七烷-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六烷-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五烷-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一烷-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十烷-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十烷-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六烷-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八烷-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九烷-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十烷-11,14-二烯-1-基]吡咯啶、(20Z)-N,N-二甲基二十七烷-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七烷-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九烷-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九烷-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三烷-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九烷-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一烷-22-烯-10- 胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五烷-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二烷-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]二十七烷-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基環丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]二十一烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十六烷-8-胺、N,N-二甲基-[(1R,2S)-2-十一基環丙基]十四烷-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]庚基}十二烷-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基環丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基環丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十五烷-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯啶、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吖丁啶、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八烷-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十烷-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二 十烷-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十烷-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二烷-13,16-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二烷-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二烷-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二烷-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六烷-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基環丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺及(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九烷-11,20,2-三烯-10-胺或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 |
| [0468] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之LNP調配物可含有3%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之LNP調配物可含有1.5%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。 |
| [0469] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗之醫藥組合物可包括至少一種在國際公開案第WO2012099755號中所述之聚乙二醇化脂質，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0470] | 在一些實施例中，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一些實施例中，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000、此項技術中已知之陽離子脂質及至少一種其他組分。在一些實施例中， LNP調配物可含有PEG-DMG 2000、此項技術中已知之陽離子脂質、DSPC及膽固醇。作為一非限制性實例，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC及膽固醇。作為另一非限制性實例，LNP調配物可含有莫耳比為2：40：10：48之PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC及膽固醇(參見例如Geall等人，Nonviral delivery of self-amplifying RNA(e.g.,mRNA)vaccines,PNAS 2012；PMID：22908294，其各自內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0471] | 本文所述之脂質奈米粒子可在無菌環境中製得。 |
| [0472] | 在一些實施例中，LNP調配物可在諸如核酸-脂質粒子之奈米粒子中調配。作為一非限制性實例，脂質粒子可包含一或多種活性劑或治療劑；一或多種陽離子脂質(佔粒子中存在之總脂質之約50mol%至約85mol%)；一或多種非陽離子脂質(佔粒子中存在之總脂質之約13mol%至約49.5mol%)；及一或多種抑制粒子凝集之結合脂質(佔粒子中存在之總脂質之約0.5mol%至約2mol%)。 |
| [0473] | 奈米粒子調配物可包含磷酸酯結合物。磷酸酯結合物可增加活體內循環次數及/或增加奈米粒子之靶向傳遞。作為一非限制性實例，磷酸酯結合物可包括如國際申請案第WO2013033438號中所述之任一式之化合物，該國際申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0474] | 奈米粒子調配物可包含聚合物結合物。聚合物結合物可為水溶性結合物。聚合物結合物可具有如美國專利申請案第20130059360號中所述之結構，該專利申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，具有本發明之聚核苷酸之聚合物結合物可使用美國專利申請案第20130072709號中所述之 方法及/或分段聚合試劑製得，該專利申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，聚合物結合物可具有包含環部分之側位側基，諸如(但不限於)美國專利公開案第US20130196948號中所述之聚合物結合物，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0475] | 奈米粒子調配物可包含結合物以增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞。另外，結合物可抑制奈米粒子在個體中之吞噬細胞清除率。在一態樣中，結合物可為由人類膜蛋白CD47設計之「自身」肽(例如，Rodriguez等人(Science 2013 339,971-975)所述之「自身」粒子，其以全文引用之方式併入本文中)。如Rodriguez等人證實，自身肽延遲巨噬細胞介導之奈米粒子清除，其增強奈米粒子之傳遞。在另一態樣中，結合物可為膜蛋白CD47(例如，參見Rodriguez等人Science 2013,339,971-975，其以全文引用之方式併入本文中)。Rodriguez等人證實，類似於「自身」肽，CD47與雜亂肽及PEG塗佈奈米粒子相比可增加個體中之循環粒子比。 |
| [0476] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗在包含結合物之奈米粒子中調配以增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞。結合物可為CD47膜或結合物可源自CD47膜蛋白，諸如前文所述之「自身」肽。在一些實施例中，奈米粒子可包含PEG及CD47結合物或其衍生物。在一些實施例中，奈米粒子可包含上文所述之「自身」肽與膜蛋白CD47。 |
| [0477] | 在一些實施例中，如本文關於傳遞本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗所述，「自身」肽及/或CD47蛋白可與病毒樣粒子或假病毒粒子結合。 |
| [0478] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗醫藥組合物包含 本發明之聚核苷酸及可具有可降解鍵聯之結合物。結合物之非限制性實例包括包含可電離氫原子之芳族部分、間隔基部分及水溶性聚合物。作為一非限制性實例，包含具有可降解鍵聯之結合物的醫藥組合物及用於傳遞該等醫藥組合物之方法在美國專利公開案第US20130184443號中描述，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0479] | 奈米粒子調配物可為包含碳水化合物載劑及RNA(例如，mRNA)疫苗之碳水化合物奈米粒子。作為一非限制性實例，碳水化合物載劑可包括(但不限於)經酸酐改質之植物糖原或肝糖型材料、植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、經酸酐改質之植物糖原β-糊精。(參見例如國際公開案第WO2012109121號，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0480] | 本發明之奈米粒子調配物可塗佈界面活性劑或聚合物以改良粒子之傳遞。在一些實施例中，奈米粒子可塗佈親水性塗料，諸如(但不限於)PEG塗料及/或具有中性表面電荷之塗料。親水性塗料可有助於傳遞具有較大有效負載之奈米粒子，諸如(但不限於)中樞神經系統內之RNA(例如，mRNA)疫苗。作為一非限制性實例，包含親水性塗料之奈米粒子及製造該等奈米粒子之方法在美國專利公開案第US20130183244號中描述，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0481] | 在一些實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為親水性聚合物粒子。親水性聚合物粒子及製造親水性聚合物粒子之方法之非限制性實例在美國專利公開案第US20130210991號中描述，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0482] | 在一些實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為疏水性聚合物粒子。 |
| [0483] | 可藉由以稱為快速消除之脂質奈米粒子(reLNP)之生物可降解陽離子脂質替代陽離子脂質來改良脂質奈米粒子調配物。可電離陽離子脂質(諸如(但不限於)DLinDMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA)已證實隨時間流逝在血漿及組織中積聚且可為毒性之潛在來源。在大鼠體內，快速消除脂質之快速代謝可使脂質奈米粒子之耐受性及治療指數改良1mg/kg劑量至10mg/kg劑量之數量級。包涵酶促降解酯鍵聯可改良陽離子組分之降解及代謝概況，同時仍維持reLNP調配物之活性。酯鍵聯在內部可位於脂質鏈內或其在末端可位於脂質鏈之末端。內部酯鍵聯可置換脂質鏈中之任何碳。 |
| [0484] | 在一些實施例中，內部酯鍵聯可位於飽和碳之任一側。 |
| [0485] | 在一些實施例中，可藉由傳遞脂質奈米粒子引發免疫反應，該脂質奈米粒子可包括奈米物種、聚合物及免疫原。(美國公開案第20120189700號及國際公開案第WO2012099805號，該等公開案各自以全文引用之方式併入本文中)。聚合物可囊封奈米物種或部分囊封奈米物種。免疫原可為本文所述之重組蛋白、經修飾之RNA及/或聚核苷酸。在一些實施例中，脂質奈米粒子可經調配用於諸如(但不限於)針對病原體之疫苗中。 |
| [0486] | 脂質奈米粒子可經工程化以改變粒子之表面特性以使得脂質奈米粒子可滲透黏膜障壁。黏液位於諸如(但不限於)口腔(例如，口腔及食管膜及扁桃體組織)、眼睛、胃腸(例如，胃、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻、呼吸道(例如，鼻、咽、氣管及支氣管膜)、生殖器(例如，陰道、子宮頸及尿道膜)之黏膜組織上。對於較高藥物囊封效率及能夠提供多種藥物之持續傳遞而言較佳之大於10至200nm之奈米粒子被認為過大而無法快速擴散穿過黏膜障壁。黏液持續分泌、流出、丟棄或消化及再循環，以使得大部分 截留粒子可在數秒或幾小時內自黏膜組織移除。經低分子量聚乙二醇(PEG)密集塗佈之大聚合奈米粒子(直徑為200nm至500nm)僅比相同粒子在水中擴散低4至6倍地擴散穿過黏液(Lai等人PNAS 2007 104(5)：1482-487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158-171；其各自以全文引用之方式併入本文中)。奈米粒子之傳輸可使用滲透速率及/或螢光顯微技術來確定，包括(但不限於)光漂白後螢光恢復(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)及高解析度多粒子追蹤(high resolution multiple particle tracking，MPT)。作為一非限制性實例，可滲透黏膜障壁之組合物可如美國專利第8,241,670號或國際專利公開案第WO2013110028號中所述來製備，該專利及專利公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0487] | 經工程化以滲透黏液之脂質奈米粒子可包含聚合材料(亦即，聚合核)及/或聚合物-維生素結合物及/或三嵌段共聚物。聚合材料可包括(但不限於)聚胺、聚醚、聚醯胺、聚酯、聚胺基甲酸酯(polycarbamate)、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚醯亞胺、聚碸、聚胺基甲酸酯(polyurethane)、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚異氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚芳酯。聚合材料可為生物可降解及/或生物相容的。生物相容性聚合物之非限制性實例在國際專利公開案第WO2013116804號中描述，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。聚合材料可額外經輻射。作為一非限制性實例，聚合材料可經γ輻射(參見例如國際申請案第WO201282165號，該國際申請案以全文引用之方式併入本文中)。特異性聚合物之非限制性實例包括聚(己內酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙 醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚胺基甲酸酯、聚-L-離胺酸(PLL)、羥丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-麩胺酸、聚(羥基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯醯胺)、聚醯胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯(諸如聚乙烯及聚丙烯)、聚烷二醇(諸如聚(乙二醇)(PEG))、聚伸烷基氧化物(PEO)、聚對苯二甲酸烷二酯(諸如聚(對苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(諸如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯鹵化物(諸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯啶酮、聚矽氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚胺基甲酸酯、衍生化纖維素(諸如烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素)、丙烯酸聚合物(諸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸異丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸異癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯))及其共聚物及混合物、聚二氧環己酮及其共聚物、聚羥基烷酸酯、聚反丁烯二酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、PEG-PLGA-PEG及三亞甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯啶酮。脂質奈米粒子可經共聚物塗佈或與共聚物締合，該共聚物諸如(但不限於)嵌段共聚物(諸如國際公開案第WO2013012476號中所述之分枝聚醚-聚醯胺嵌段共聚物，該國際公開案以全文引用之方式併入本文中)及(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共 聚物(參見例如美國公開案20120121718及美國公開案20100003337及美國專利第8,263,665號，該等公開案及專利各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。共聚物可為通常視為安全(GRAS)之聚合物且脂質奈米粒子之形成可經由無新的化學實體產生之方式。例如，脂質奈米粒子可包含塗佈PLGA奈米粒子之泊洛沙姆，而不形成仍能夠快速滲透人類黏液之新的化學實體(Yang等人Angew.Chem.Int.編.2011 50：2597-2600；其內容以全文引用之方式併入本文中)。一種用於產生可滲透人類黏液之奈米粒子的非限制性可擴展方法由Xu等人描述(參見例如J Control Release 2013,170(2)：279-86，其內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0488] | 聚合物-維生素結合物之維生素可為維生素E。結合物之維生素部分可經其他合適組分取代，該等組分諸如(但不限於)維生素A、維生素E、其他維生素、膽固醇、疏水性部分或其他界面活性劑之疏水性組分(例如，固醇鏈、脂肪酸、烴鏈及氧化烯鏈)。 |
| [0489] | 經工程化以滲透黏液之脂質奈米粒子可包括表面改變劑，諸如(但不限於)聚核苷酸、陰離子蛋白(例如，牛血清白蛋白)、界面活性劑(例如，陽離子界面活性劑，諸如二甲基雙十八烷基-溴化銨)、糖類或糖衍生物(例如，環糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇及泊洛沙姆)、黏液分解劑(例如，N-乙醯基半胱胺酸、艾、鳳梨酶、木瓜酶、大青屬、乙醯基半胱胺酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司鈉(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奧醇(domiodol)、萊託斯坦(letosteine)、司替羅寧(stepronin)、硫普羅寧(tiopronin)、凝溶膠蛋白(gelsolin)、胸腺素β4阿法鏈道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))及 各種DNA酶，包括rhDNA酶。表面改變劑可嵌埋或陷入粒子表面中或安置(例如，藉由塗佈、吸附、共價鍵聯或其他方法)於脂質奈米粒子表面上。(參見例如美國公開案20100215580及美國公開案20080166414及US20130164343，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0490] | 在一些實施例中，黏液滲透脂質奈米粒子可包含至少一種本文所述之聚核苷酸。聚核苷酸可囊封於脂質奈米粒子中及/或安置於粒子表面上。聚核苷酸可與脂質奈米粒子共價偶合。黏液滲透脂質奈米粒子之調配物可包含複數個奈米粒子。進一步地，調配物可含有可與黏液相互作用且改變周圍黏液之結構及/或黏附特性之粒子以減小黏膜黏附，此可增加黏液滲透脂質奈米粒子傳遞至黏膜組織。 |
| [0491] | 在一些實施例中，黏液滲透脂質奈米粒子可為包含黏膜滲透增強塗料之低滲壓調配物。調配物對於其所傳遞之上皮細胞可具低滲壓。低滲壓調配物之非限制性實例可見於國際專利公開案第WO2013110028號，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0492] | 在一些實施例中，為增強經由黏膜障壁之傳遞，RNA(例如，mRNA)疫苗調配物可包含或可為低滲壓溶液。發現低滲壓溶液可增加黏膜惰性粒子(諸如(但不限於)黏液滲透粒子)能夠到達陰道上皮表面之速率(參見例如Ensign等人Biomaterials 2013,34(28)：6922-9，其內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0493] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗經調配為脂質核酸複合物(lipoplex)，諸如(不限於)來自Silence Therapeutics(London,United Kingdom)之ATUPLEXTM系統、DACC系統、DBTC系統及其他siRNA-脂質核酸複合物技術，來自 STEMGENT®(Cambridge,MA)之STEMFECTTM及基於聚乙烯亞胺(PEI)或魚精蛋白之定靶及非定靶傳遞核酸(Aleku等人Cancer Res.2008 68：9788-9798；Strumberg等人Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50：76-78；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Kaufmann等人Microvasc Res 2010 80：286-293；Weide等人J Immunother.2009 32：498-507；Weide等人J Immunother.2008 31：180至188；Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4：1285-1294；Fotin-Mleczek等人，2011 J.Immunother.34：1-15；Song等人，Nature Biotechnol.2005、23：709-717；Peer等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007 6；104：4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0494] | 在一些實施例中，亦可構建該等調配物或改變其組成以使其被動地或主動地經活體內導向不同之細胞類型，包括(但不限於)肝細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、抗原呈現細胞及白血球(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Judge等人，J Clin Invest.2009 119：661-673；Kaufmann等人，Microvasc Res 2010 80：286-293；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Basha等人，Mol.Ther.2011 19：2186-2200；Fenske及Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5：25-44；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer及Lieberman,Gene Ther.2011 18：1127-1133，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。將調配物被動靶向肝細胞之一種實例包括基於DLin-DMA、DLin-KC2-DMA 及DLin-MC3-DMA之脂質奈米粒子調配物，其已證實結合至脂蛋白元E且促使該等調配物經活體內結合且吸收至肝細胞中(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；其內容以全文引用之方式併入本文中)。如(但不限於)葉酸鹽、轉鐵蛋白、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)及抗體靶向方法所例示，亦可經由在其表面上表現不同配位體來選擇性地靶向調配物(Kolhatkar等人，Curr Drug Discov Technol.2011 8：197-206；Musacchio及Torchilin,Front Biosci.2011 16：1388-1412；Yu等人，Mol Membr Biol.2010 27：286-298；Patil等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25：1-61；Benoit等人，Biomacromolecules.2011 12：2708-2714；Zhao等人，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：309-319；Akinc等人，Mol Ther.2010 18：1357-1364；Srinivasan等人，Methods Mol Biol.2012 820：105-116；Ben-Arie等人，Methods Mol Biol.2012 757：497-507；Peer 2010 J Control Release.20：63-68；Peer等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104：4095-4100；Kim等人，Methods Mol Biol.2011 721：339-353；Subramanya等人，Mol Ther.2010 18：2028-2037；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer及Lieberman,Gene Ther.2011 18：1127-1133，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0495] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗經調配為固體脂質奈米粒子。固體脂質奈米粒子(SLN)可為平均直徑在10至1000nm之間之球形。SLN具有可溶解親脂性分子之固體脂質核基質且可由界面活性劑及/或乳化劑穩定。在一些實施例中，脂質奈米粒子可為自組裝脂質-聚合物奈米粒子(參見Zhang等人，ACS Nano,2008,2(8)，第1696至1702頁；其內容以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例，SLN可為國際專利公開案第 WO2013105101號中所述之SLN，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為另一非限制性實例，SLN可由國際專利公開案第WO2013105101號中所述之方法或製程來製備，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0496] | 脂質體、脂複合體或脂質奈米粒子可用於改良聚核苷酸定向蛋白生產之功效，因為該等調配物能夠增加RNA(例如，mRNA)疫苗之細胞轉染；及/或增加編碼蛋白之轉譯。一種此實例包涵使用脂質囊封以使得可有效地全身傳遞複合物質體DNA(Heyes等人，Mol Ther.2007 15：713-720；其內容以全文引用之方式併入本文中)。脂質體、脂複合體或脂質奈米粒子亦可用於增加聚核苷酸之穩定性。 |
| [0497] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配用於受控釋放及/或靶向傳遞。如本文所用，「受控釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果之醫藥組合物或化合物釋放概況。在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封於本文所述及/或此項技術中已知之用於受控釋放及/或靶向傳遞之傳遞劑中。如本文所用，術語「囊封」意謂圍繞、包圍或包裝。在與本發明化合物之調配物相關時，囊封可為實質上、完全或部分的。術語「實質上囊封」意謂至少大於50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或大於99.999%之本發明之醫藥組合物或化合物可由傳遞劑圍繞、包圍或包裝。「部分囊封」意謂小於10、10、20、30、40、50或50%以下之本發明之醫藥組合物或化合物可由傳遞劑圍繞、包圍或包裝。有利地，囊封可藉由使用螢光及/或電子顯微照片量測本發明之醫藥組合物或化合物之洩漏或活性來確定。例如，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大於 99.99%之本發明之醫藥組合物或化合物囊封於傳遞劑中。 |
| [0498] | 在一些實施例中，受控釋放調配物可包括(但不限於)三嵌段共聚物。作為一非限制性實例，調配物可包括兩種不同類型之三嵌段共聚物(國際公開案第WO2012131104號及第WO2012131106號；該等國際公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0499] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封於脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子中且脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子隨後可囊封於本文所述及/或此項技術中已知之聚合物、水凝膠及/或手術密封劑中。作為一非限制性實例，聚合物、水凝膠或手術密封劑可為PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、GELSITE®(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、HYLENEX®(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、手術密封劑(諸如纖維蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA))、TISSELL®(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基於PEG之密封劑及COSEAL®(Baxter International,Inc Deerfield,IL)。 |
| [0500] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子可囊封於此項技術中已知之在注射至個體中時可形成凝膠之任何聚合物中。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可囊封於可生物降解之聚合物基質中。 |
| [0501] | 在一些實施例中，用於受控釋放及/或靶向傳遞之RNA(例如，mRNA)疫苗調配物亦可包括至少一種受控釋放塗層。受控釋放塗層包括(但不限於)OPADRY®、聚乙烯吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、EUDRAGIT RL®、EUDRAGIT RS®及纖維素衍生物，諸如乙基纖維素水性分散液(AQUACOAT®及SURELEASE®)。 |
| [0502] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗受控釋放及/或靶向傳遞調配物可包含至少一種可含有聚陽離子側鏈之可降解聚酯。可降解聚酯包括(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在一些實施例中，可降解聚酯可包括PEG共軛以形成聚乙二醇化聚合物。 |
| [0503] | 在一些實施例中，包含至少一種聚核苷酸之RNA(例如，mRNA)疫苗受控釋放及/或靶向傳遞調配物可包含至少一種如美國專利第8,404,222號中所述之PEG及/或PEG相關聚合物衍生物，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0504] | 在一些實施例中，包含至少一種聚核苷酸之RNA(例如，mRNA)疫苗受控釋放傳遞調配物可為US20130130348中所述之受控釋放聚合物系統，其內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0505] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封於治療性奈米粒子中，在本文中稱為「治療性奈米粒子RNA(例如，mRNA)疫苗」。治療性奈米粒子可由本文所述且此項技術中已知之方法來調配，此項技術諸如(但不限於)國際公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號、第WO2010005721號、第WO2010005723號、第WO2012054923號、美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號、第US20100068285號、第US20110274759號、第US20100068286號、第US20120288541號、第US20130123351號及第US20130230567號及美國專利第號8,206,747號、第8,293,276號、第8,318,208號及第8,318,211號；該等公開案及專利各自之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，治療性聚合物奈米粒子可由美國公開案第US20120140790號中所述之方法來標識，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0506] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配用於持續釋放。如本文所用，「持續釋放」係指在規定時間段內符合一定釋放速率之醫藥組合物或化合物。該時間段可包括(但不限於)數小時、數天、數週、數月及數年。作為一非限制性實例，持續釋放奈米粒子可包含聚合物及治療劑，諸如(但不限於)本發明之聚核苷酸(參見國際公開案第2010075072號及美國公開案第US20100216804號、第US20110217377號及第US20120201859號，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，持續釋放調配物可包含允許持久生物可用性之藥劑，諸如(但不限於)晶體、大分子凝膠及/或微粒懸浮液(參見美國專利公開案第US20130150295號，該專利公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0507] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配為標靶特異性。作為一非限制性實例，治療性奈米粒子可包括皮質類固醇(參見國際公開案第WO2011084518號，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例，治療性奈米粒子可在國際公開案第WO2008121949號、第WO2010005726號、第WO2010005725號、第WO2011084521號及美國公開案第US20100069426號、第US20120004293號及第US20100104655號中所述之奈米粒子中調配，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0508] | 在一些實施例中，本發明之奈米粒子可包含聚合基質。作為一非限制性實例，奈米粒子可包含兩種或兩種以上聚合物，諸如(但不限於)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、 聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。 |
| [0509] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子包含二嵌段共聚物。在一些實施例中，二嵌段共聚物可包括與諸如(但不限於)以下之聚合物組合之PEG：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。又在另一實施例中，二嵌段共聚物可為諸如國際專利公開案第WO2013120052號中所述之彼等高-X二嵌段共聚物，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0510] | 作為一非限制性實例，治療性奈米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(參見美國公開案第US20120004293號及美國專利第8,236,330號，該公開案及專利各自以全文引用之方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，治療性奈米粒子為包含PEG與PLA或PEG與PLGA之二嵌段共聚物之隱形奈米粒子(參見美國專利第8,246,968號及國際公開案第WO2012166923號，該專利及國際公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。又在另一非限制性實例中，治療性奈米粒子為如美國專利公開案第US20130172406號中所述之隱形奈米粒子或標靶特異性隱形奈米粒子，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0511] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含多嵌段共聚物(參見例如美國專利第8,263,665號及第8,287,910號及美國專利公開案 第US20130195987號，該專利及專利公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0512] | 又在另一非限制性實例中，脂質奈米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(參見例如，熱敏性水凝膠(PEG-PLGA-PEG)，其在Lee等人Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-β1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.Pharmaceutical Research,2003 20(12)：1995-2000中用作TGF-β1基因傳遞媒劑；且在Li等人Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel.Pharmaceutical Research 2003 20(6)：884-888中用作受控基因傳遞系統；及Chang等人，Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.J Controlled Release.2007 118：245-253；其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物之脂質奈米粒子中調配。 |
| [0513] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含多嵌段共聚物(參見例如美國專利第8,263,665號及第8,287,910號及美國專利公開案第US20130195987號，該專利及專利公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0514] | 在一些實施例中，本文所述之嵌段共聚物可包括在包含非聚合微胞及嵌段共聚物之聚離子複合物中。(參見例如美國公開案第20120076836號，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0515] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種丙烯酸系聚合物。丙烯酸系聚合物包括(但不限於)丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸與甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙氧基甲 基丙烯酸乙酯、氰基甲基丙烯酸乙酯、胺基甲基丙烯酸烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合。 |
| [0516] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可為共聚物，諸如無規共聚物。作為一非限制性實例，無規共聚物可具有諸如國際申請案第WO2013032829號或美國專利公開案第US20130121954號中所述之彼等結構，該申請案及專利公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，聚(乙烯基酯)聚合物可與本文所述之聚核苷酸結合。 |
| [0517] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可為(但不限於)聚(乳酸)-聚(乙二醇)共聚物(參見例如國際專利公開案第WO2013044219號，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例，治療性奈米粒子可用於治療癌症(參見國際公開案第WO2013044219號，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0518] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種本文所述及/或此項技術中已知之陽離子聚合物。 |
| [0519] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種含胺聚合物，諸如(但不限於)聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物、聚(β-胺基酯)(參見例如美國專利第8,287,849號，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中)及其組合。 |
| [0520] | 在一些實施例中，本文所述之奈米粒子可包含胺陽離子脂質，諸如國際專利申請案第WO2013059496號中所述之彼等，該專利申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，陽離子脂質可具有胺基-胺或胺基-醯胺部分。 |
| [0521] | 在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種可含有聚陽離子側鏈之可降解聚酯。可降解聚酯包括(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在一些實施例中，可降解聚酯可包括PEG共軛以形成聚乙二醇化聚合物。 |
| [0522] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可含有免疫刺激劑以增強來自傳遞合成性奈米載劑之免疫反應。作為一非限制性實例，合成性奈米載劑可包含可增強免疫系統之基於Th1之反應的Th1免疫刺激劑(參見國際公開案第WO2010123569號及美國公開案第20110223201號，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0523] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可經調配以用於靶向釋放。在一些實施例中，合成性奈米載劑經調配從而在規定pH值下及/或在所需之時間間隔後釋放聚核苷酸。作為一非限制性實例，合成性奈米粒子可經調配以在24小時後及/或在4.5之pH值下釋放RNA(例如，mRNA)疫苗(參見國際公開案第WO2010138193號及第WO2010138194號及美國公開案第US20110020388號及第US20110027217號，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0524] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可經調配以用於受控及/或持續釋放本文所述之聚核苷酸。作為一非限制性實例，用於持續釋放之合成性奈米載劑可由此項技術中已知、本文所述及/或如國際公開案第WO2010138192號及美國公開案第20100303850號中所述之方法來調配，該等公開案各自以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0525] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配以用於 受控及/或持續釋放，其中該調配物包含至少一種聚合物，該聚合物為結晶側鏈(CYSC)聚合物。CYSC聚合物在美國專利第8,399,007號中描述，該專利以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0526] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可經調配以用作疫苗。在一些實施例中，合成性奈米載劑可囊封至少一種編碼至少一種抗原之聚核苷酸。作為一非限制性實例，合成性奈米載劑可包括至少一種抗原及用於疫苗劑型之賦形劑(參見國際公開案第WO2011150264號及美國公開案第US20110293723號，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。作為另一非限制性實例，疫苗劑型可包括至少兩種具有相同或不同抗原及賦形劑之合成性奈米載劑(參見國際公開案第WO2011150249號及美國公開案第US20110293701號，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。疫苗劑型可由本文所述、此項技術中已知及/或國際公開案第WO2011150258號及美國公開案第US20120027806號中所述之方法來選擇，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0527] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可包含至少一種編碼至少一種佐劑之聚核苷酸。作為一非限制性實例，佐劑可包含二甲基雙十八烷基溴化銨、二甲基雙十八烷基氯化銨、二甲基雙十八烷基磷酸銨或二甲基雙十八烷基乙酸銨(DDA)及分枝桿菌屬之總脂質萃取物之非極性部分或該非極性部分之部分(參見例如美國專利第8,241,610號；該專利之內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，合成性奈米載劑可包含至少一種聚核苷酸及佐劑。作為一非限制性實例，包含佐劑之合成性奈米載劑可由國際公開案第WO2011150240號及美國公開案第US20110293700號中所述之方法來調配，該等公開案各自之內容以全文引用之方 式併入本文中。 |
| [0528] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可囊封至少一種編碼來自病毒之肽、片段或區域之聚核苷酸。作為一非限制性實例，合成性奈米載劑可包括(但不限於)國際公開案第WO2012024621號、第WO201202629號、第WO2012024632號及美國公開案第US20120064110號、第US20120058153號及第US20120058154號中所述之任何奈米載劑，該等公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0529] | 在一些實施例中，合成性奈米載劑可與能夠觸發體液性及/或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應之聚核苷酸偶合(參見例如國際公開案第WO2013019669號，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0530] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封於兩性離子脂質中、連接至兩性離子脂質及/或與兩性離子脂質締合。兩性離子脂質之非限制性實例及使用兩性離子脂質之方法在美國專利公開案第20130216607號中描述，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，兩性離子脂質可用於本文所述之脂質體及脂質奈米粒子中。 |
| [0531] | 在一些實施例中，如美國專利公開案第20130197100號中所述，RNA(例如，mRNA)疫苗可在膠體奈米載劑中調配，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0532] | 在一些實施例中，奈米粒子可經最佳化以供口服。奈米粒子可包含至少一種陽離子生物聚合物，諸如(但不限於)幾丁聚醣或其衍生物。作為一非限制性實例，奈米粒子可由美國公開案第20120282343號中所述之方法來調配；該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0533] | 在一些實施例中，LNP包含脂質KL52(美國申請案公開案第2012/0295832號中揭示之胺基-脂質，該申請案公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。可藉由併入該等脂質來改良LNP投藥之活性及/或安全性(如藉由檢查ALT/AST、白血球計數及細胞激素誘發中之一或多者來量測)。包含KL52之LNP可經靜脈內投與及/或以一或多次給藥投與。在一些實施例中，投與包含KL52之LNP與包含MC3之LNP相比導致相等或改良之mRNA及/或蛋白表現。 |
| [0534] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可使用較小之LNP來傳遞。該等粒子可包含低於0.1um直至100nm之直徑，諸如(但不限於)小於0.1um、小於1.0um、小於5um、小於10um、小於15um、小於20um、小於25um、小於30um、小於35um、小於40um、小於50um、小於55um、小於60um、小於65um、小於70um、小於75um、小於80um、小於85um、小於90um、小於95um、小於100um、小於125um、小於150um、小於175um、小於200um、小於225um、小於250um、小於275um、小於300um、小於325um、小於350um、小於375um、小於400um、小於425um、小於450um、小於475um、小於500um、小於525um、小於550um、小於575um、小於600um、小於625um、小於650um、小於675um、小於700um、小於725um、小於750um、小於775um、小於800um、小於825um、小於850um、小於875um、小於900um、小於925um、小於950um、小於975um或小於1000um。 |
| [0535] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可使用較小LNP來傳遞，該等較小LNP可包含約1nm至約100nm、約1nm至約10nm、約1nm至約20nm、約1nm至約30nm、約1nm至約40nm、 約1nm至約50nm、約1nm至約60nm、約1nm至約70nm、約1nm至約80nm、約1nm至約90nm、約5nm至約100nm、約5nm至約10nm、約5nm至約20nm、約5nm至約30nm、約5nm至約40nm、約5nm至約50nm、約5nm至約60nm、約5nm至約70nm、約5nm至約80nm、約5nm至約90nm、約10至約50nm、約20至約50nm、約30至約50nm、約40至約50nm、約20至約60nm、約30至約60nm、約40至約60nm、約20至約70nm、約30至約70nm、約40至約70nm、約50至約70nm、約60至約70nm、約20至約80nm、約30至約80nm、約40至約80nm、約50至約80nm、約60至約80nm、約20至約90nm、約30至約90nm、約40至約90nm、約50至約90nm、約60至約90nm及/或約70至約90nm之直徑。 |
| [0536] | 在一些實施例中，使用包含微流體混合器之方法來合成該等LNP。微流體混合器之實例可包括(但不限於)狹縫數位間微混合器，包括(但不限於)Microinnova(Allerheiligen bei Wildon,Austria)製造之彼等微混合器及/或交錯人字形微混合器(SHM)(Zhigaltsev,I.V.等人，Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing have been published(Langmuir.2012.28：3633-40；Belliveau,N.M.等人，Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-Nucleic Acids.2012.1：e37；Chen,D.等人，Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am Chem Soc.2012.134(16)：6948-51，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，產生包含SHM之LNP之方法進一步包括 將至少兩種輸入流混合，其中藉由微結構誘發之混沌對流(microstructure-induced chaotic advection，MICA)來進行混合。根據此方法，流體流流經以人字形圖案形式存在之通道，導致旋轉流動且使流體在彼此周圍摺疊。此方法亦可包含供流體混合之表面，其中該表面在流體循環期間改變方向。使用SHM產生LNP之方法包括美國申請案公開案第2004/0262223號及第2012/0276209號中揭示之彼等方法，該等申請案公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0537] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微混合器產生之脂質奈米粒子中調配，該微混合器諸如(但不限於)狹縫數位間微結構混合器(SIMM-V2)或標準狹縫數位間微混合器(SSIMM)或來自Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH,Mainz Germany之履帶裝置(Caterpillar，CPMM)或衝擊-噴射(Impinging-jet，IJMM)。 |
| [0538] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微流體技術產生之脂質奈米粒子中調配(參見例如Whitesides,George M.The Origins and the Future of Microfluidics.Nature,2006 442：368-373；及Abraham等人Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295：647-651；其各自以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例，受控微流體調配物包括一種被動方法用於以低雷諾數(Reynolds number)在微通道中混合穩壓驅動流之流動(參見例如Abraham等人Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295：647-651；其內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0539] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微混合器晶片產生之脂質奈米粒子中調配，諸如(但不限於)來 自Harvard Apparatus(Holliston,MA)或Dolomite Microfluidics(Royston,UK)之彼等微混合器晶片。微混合器晶片可用於以分流及重組機制快速混合兩種或兩種以上流體流。 |
| [0540] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配用於使用國際專利公開案第WO2013063468號或美國專利第8,440,614號中所述之藥物囊封微球體來傳遞，該國際專利公開案及專利各自之內容以全文引用之方式併入本文中。微球體可包含如國際專利公開案第WO2013063468號中所述之式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)之化合物，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，胺基酸、肽、多肽、脂質(APPL)適用於將本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗傳遞至細胞(參見國際專利公開案第WO2013063468號，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0541] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂質奈米粒子中調配，該等脂質奈米粒子具有約10至約100nm之直徑，諸如(但不限於)約10至約20nm、約10至約30nm、約10至約40nm、約10至約50nm、約10至約60nm、約10至約70nm、約10至約80nm、約10至約90nm、約20至約30nm、約20至約40nm、約20至約50nm、約20至約60nm、約20至約70nm、約20至約80nm、約20至約90nm、約20至約100nm、約30至約40nm、約30至約50nm、約30至約60nm、約30至約70nm、約30至約80nm、約30至約90nm、約30至約100nm、約40至約50nm、約40至約60nm、約40至約70nm、約40至約80nm、約40至約90nm、約40至約100nm、約50至約60nm、約50至約70nm約50至約80nm、約50至約90nm、約50至約100nm、約60至約70nm、約60至約80nm、約60至約90nm、約60至約100nm、約70至約80nm、約70至 約90nm、約70至約100nm、約80至約90nm、約80至約100nm及/或約90至約100nm。 |
| [0542] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子可具有約10至500nm之直徑。 |
| [0543] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子可具有大於100nm、大於150nm、大於200nm、大於250nm、大於300nm、大於350nm、大於400nm、大於450nm、大於500nm、大於550nm、大於600nm、大於650nm、大於700nm、大於750nm、大於800nm、大於850nm、大於900nm、大於950nm或大於1000nm之直徑。 |
| [0544] | 在一些實施例中，脂質奈米粒子可為國際專利公開案第WO2013059922號中所述之極限尺寸脂質奈米粒子，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。極限尺寸脂質奈米粒子可包含圍繞含水核或疏水核之脂質雙層；其中脂質雙層可包含磷脂，諸如(但不限於)二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂、腦苷脂、C8-C20脂肪酸二醯基磷脂醯膽鹼及1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)。在一些實施例中，極限尺寸脂質奈米粒子可包含聚乙二醇-脂質，諸如(但不限於)DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG及DSPE-PEG。 |
| [0545] | 在一些實施例中，可使用國際專利公開案第WO2013063530號中所述之傳遞方法使RNA(例如，mRNA)疫苗在特定位置處傳遞、定位及/或集中於特定位置，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，可在向個體傳遞RNA(例如，mRNA)疫苗之前、與此同時或在此之後向個體投與空的聚合粒子。空的聚合粒子一旦與個體接觸，即經歷體積變化，且安置、嵌埋、固定或截留於個體內之特定位置處。 |
| [0546] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在活性物質釋放系統中調配(參見例如美國專利公開案第US20130102545號，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。活性物質釋放系統可包含1)與催化活性核酸雜合之寡核苷酸抑制劑鏈所黏結之至少一種奈米粒子及2)與治療活性物質(例如，本文所述之聚核苷酸)黏結之至少一種受質分子所黏結之化合物，其中藉由催化活性核酸裂解受質分子而釋放治療活性物質。 |
| [0547] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在奈米粒子中調配，該奈米粒子包括包含非細胞物質之內部核及包含細胞膜之外表面。細胞膜可源自細胞或源自病毒之膜。作為一非限制性實例，奈米粒子可由國際專利公開案第WO2013052167號中所述之方法來製備，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為另一非限制性實例，國際專利公開案第WO2013052167號中所述之奈米粒子可用於傳遞本文所述之RNA(例如，mRNA)疫苗，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0548] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在由多孔奈米粒子支撐之脂質雙層(原始細胞)中調配。原始細胞在國際專利公開案第WO2013056132號中描述，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0549] | 在一些實施例中，本文所述之RNA(例如，mRNA)疫苗可在如美國專利第8,420,123號及第8,518,963號及歐洲專利第EP2073848B1號中所述之聚合奈米粒子中調配或由其中所述之方法來製備，該等專利各自之內容以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，聚合奈米粒子可具有高玻璃轉移溫度，諸如美國專利第8,518,963號中所述之奈米粒子或由其中所述之方法 製備之奈米粒子，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。作為另一非限制性實例，用於口服及非經腸調配物之聚合物奈米粒子可由歐洲專利第EP2073848B1號中所述之方法來製備，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0550] | 在一些實施例中，本文所述之RNA(例如，mRNA)疫苗可在用於成像之奈米粒子中調配。奈米粒子可為諸如美國專利公開案第US20130129636號中所述之彼等脂質體奈米粒子，該專利公開案以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，脂質體可包含2-{4,7-雙-羧甲基-10-[(N,N-二硬脂醯基醯胺基甲基-N'-醯胺基-甲基]-1,4,7,10-四-氮雜環十二-1-基}-乙酸釓(III)及中性完全飽和磷脂組分(參見例如美國專利公開案第US20130129636號，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0551] | 在一些實施例中，可用於本發明之奈米粒子由美國專利申請案第US20130130348號中所述之方法形成，該專利申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0552] | 本發明之奈米粒子可進一步包括營養素，諸如(但不限於)其缺乏可導致貧血至神經管缺損之健康危害之彼等營養素(參見例如國際專利公開案第WO2013072929號中所述之奈米粒子，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例，營養素可為亞鐵鹽、鐵鹽或鐵元素形式之鐵、碘、葉酸、維生素或微量營養素。 |
| [0553] | 在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在可膨脹奈米粒子中調配。可膨脹奈米粒子可為(但不限於)美國專利第8,440,231號中所述之彼等奈米粒子，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實施例，可膨脹奈米粒子可用於將本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗傳遞至肺系統(參見例如 美國專利第8,440,231號，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中)。 |
| [0554] | 本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在諸如(但不限於)美國專利第8,449,916號中所述之彼等聚酸酐奈米粒子中調配，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0555] | 本發明之奈米粒子及微米粒子可經幾何學工程化以調節巨噬細胞及/或免疫反應。在一些實施例中，經幾何學工程化之粒子可具有不同之形狀、大小及/或表面電荷以合併本發明之聚核苷酸從而用於靶向傳遞，諸如(但不限於)肺傳遞(參見例如國際公開案第WO2013082111號，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中)。幾何學工程化粒子可具有之其他物理特徵包括(但不限於)可改變與細胞及組織之相互作用的開窗術、角度臂、非對稱性及表面粗糙度、電荷。作為一非限制性實例，本發明之奈米粒子可由國際公開案第WO2013082111號中所述之方法來製備，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0556] | 在一些實施例中，本發明之奈米粒子可為水溶性奈米粒子，諸如(但不限於)國際公開案第WO2013090601號中所述之彼等奈米粒子，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。奈米粒子可為具有緻密及兩性離子配位體之無機奈米粒子以展示良好之水溶解性。奈米粒子亦可具有小流體動力學直徑(HD)、關於時間、pH及鹽度之穩定性以及低水準之非特異性蛋白結合。 |
| [0557] | 在一些實施例中，本發明之奈米粒子可由美國專利公開案第US20130172406號中所述之方法研發，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0558] | 在一些實施例中，本發明之奈米粒子為隱形奈米粒子或標靶特異性隱形奈米粒子，諸如(但不限於)美國專利公開案第 US20130172406號中所述之彼等奈米粒子，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。本發明之奈米粒子可由美國專利公開案第US20130172406號中所述之方法來製備，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0559] | 在一些實施例中，隱形或標靶特異性隱形奈米粒子可包含聚合基質。聚合基質可包含兩種或兩種以上聚合物，諸如(但不限於)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酸酐、聚醚、聚胺基甲酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其組合。 |
| [0560] | 在一些實施例中，奈米粒子可為具有高密度核酸層之奈米粒子-核酸混合結構。作為一非限制性實例，奈米粒子-核酸混合結構可由美國專利公開案第US20130171646號中所述之方法來製備，該專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。奈米粒子可包含核酸，諸如(但不限於)本文所述及/或此項技術中已知之聚核苷酸。 |
| [0561] | 本發明之至少一種奈米粒子可嵌埋於核奈米結構中或塗佈以低密度多孔3-D結構或能夠在奈米結構內或表面上攜帶或締合至少一種有效負載之塗料。包含至少一種奈米粒子之奈米結構之非限制性實例在國際專利公開案第WO2013123523號中描述，該國際專利公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0562] | 在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可與以下各物締合：陽離子或聚陽離子化合物，包括魚精蛋白、核仁素(nucleoline)、精胺或亞精胺，或其他陽離子肽或蛋白，諸如聚-L -離胺酸(PLL)、聚精胺酸、鹼性多肽、細胞滲透肽(CPP)，包括HIV-結合肽、HIV-1 Tat(HIV)、Tat衍生肽、滲透素(Penetratin)、VP22衍生肽或類似物肽、瘟病毒屬白尾海雕(Pestivirus Erns)、HSV、VP22(單純疱疹)、MAP、KALA或蛋白轉導結構域(PTD)、PpT620、富含脯胺酸之肽、富含精胺酸之肽、富含離胺酸之肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降血鈣素肽、觸角足衍生肽(尤其來自果蠅觸角足)、pAntp、pIs1、FGF、乳鐵素(Lactoferrin)、Transportan、抗菌肽-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT-衍生肽、SAP、組蛋白、陽離子多醣(例如幾丁聚醣)、聚凝胺、陽離子聚合物(例如聚乙烯亞胺(PEI))、陽離子脂質(例如DOTMA：[1-(2,3-二油基氧基)丙基)]-N,N,N-三甲基氯化銨)、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油基磷脂醯乙醇-胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS：雙十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺、DIMRI：二肉豆蔻醯氧基丙基二甲基羥乙基溴化銨、DOTAP：二油醯氧基-3-(三甲基銨基)丙烷、DC-6-14：O,O-雙十四烷醯基-N-.α.-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺鹽酸鹽、CLIP1：外消旋-[(2,3-雙十八烷氧基丙基)(2-羥乙基)]-二甲基氯化銨、CLIP6：外消旋-[2(2,3-雙十六烷氧基丙氧基甲氧基)乙基]-三甲銨、CLIP9：外消旋-[2(2,3-雙十六烷氧基丙氧基丁二醯氧基)乙基]-三甲銨、oligofectamine或陽離子或聚陽離子聚合物，例如經修飾之聚胺基酸(諸如β-胺基酸-聚合物或逆相聚醯胺等)、經修飾之聚乙烯(諸如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡錠))等)、經修飾之丙烯酸酯(諸如pDMAEMA(聚(二甲胺基乙基丙烯酸甲酯))等)、經修飾之醯胺基胺(諸如pAMAM(聚(醯胺基胺))等)、經修飾之聚β胺基酯(PBAE)(諸如二胺末端經修飾之1,4丁二醇二丙烯酸酯-共- 5-胺基-1-戊醇聚合物等)、樹枝狀聚合物(諸如聚丙基胺樹枝狀聚合物或基於pAMAM之樹枝狀聚合物等)、聚亞胺(諸如PEI：聚(乙烯亞胺)、聚(丙烯亞胺)等)、聚烯丙基胺、基於糖骨架之聚合物(諸如基於環糊精之聚合物、基於葡聚糖之聚合物、幾丁聚醣等)、基於矽烷骨架之聚合物(諸如PMOXA-PDMS共聚物等)、由一或多個陽離子嵌段(例如，選自如上文提及之陽離子聚合物)與一或多個親水性或疏水性嵌段(例如，聚乙二醇)之組合組成之嵌段聚合物，等。 |
| [0563] | 在其他實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗不與陽離子或聚陽離子化合物締合。 |
| [0564] | 在一些實施例中，奈米粒子包含式(I)化合物：  或其鹽或異構體，其中：R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’組成之群；R2與R3獨立地選自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群，或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4選自由C3-6碳環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2及未經取代之C1-6烷基組成之群，其中Q選自碳環、雜環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8O(CH2)nOR、- N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R)2C(O)OR，且每個n獨立地選自1、2、3、4及5；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基；R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；R8選自由C3-6碳環及雜環組成之群；R9選自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳環及雜環組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C2-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13。 |
| [0565] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括其中當R4為-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2時，則(i)當n為1、2、3、4或5時，Q非-N(R)2，或(ii)當n為1或2時，Q非5、6或7員雜環 烷基之彼等化合物。 |
| [0566] | 在一些實施例中，另一子集之式(I)化合物包括彼等化合物，其中R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及R”M’R’組成之群；R2及R3獨立地選自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4選自由C3-6碳環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2及未經取代之C1-6烷基組成之群，其中Q選自C3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5至14員雜芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR及具有一或多個選自N、O及S之雜原子之經一或多個選自側氧基(=O)、OH、胺基、單-或二-烷胺基及C1-3烷基之取代基取代之5至14員雜環烷基，且每個n獨立地選自1、2、3、4及5；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH-、- P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基；R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；R8選自由C3-6碳環及雜環組成之群；R9選自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳環及雜環組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C2-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構體。 |
| [0567] | 在一些實施例中，另一子集之式(I)化合物包括彼等化合物，其中R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及R”M’R’組成之群；R2及R3獨立地選自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4選自由C3-6碳環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2及未經取代之C1-6烷基組成之群，其中Q選自C3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5至14員雜環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、- N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR9)N(R)2，且每個n獨立地選自1、2、3、4及5；且當Q為5至14員雜環且(i)R4為-(CH2)nQ，其中n為1或2或(ii)R4為-(CH2)nCHQR，其中n為1或(iii)R4為-CHQR及CQ(R)2時，則Q為5至14員雜芳基或8至14員雜環烷基；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M與M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基；R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；R8選自由C3-6碳環及雜環組成之群；R9選自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳環及雜環組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C2-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13， 或其鹽或異構體。 |
| [0568] | 在一些實施例中，另一子集之式(I)化合物包括彼等化合物，其中：R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及R”M’R’組成之群；R2及R3獨立地選自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4選自由C3-6碳環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2及未經取代之C1-6烷基組成之群，其中Q選自C3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5至14員雜芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR9)N(R)2，且每個n獨立地選自1、2、3、4及5；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基；R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群； R8選自由C3-6碳環及雜環組成之群；R9選自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳環及雜環組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C2-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構體。 |
| [0569] | 在一些實施例中，另一子集之式(I)化合物包括彼等化合物，其中R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及R”M’R’之組成之群；R2及R3獨立地選自由H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4為-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q為-N(R)2，且n選自3、4及5；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基； R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C1-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構體。 |
| [0570] | 在一些實施例中，另一子集之式(I)化合物包括彼等化合物，其中R1選自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”及R”M’R’組成之群；R2及R3獨立地選自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”及R*OR”組成之群或R2與R3連同其所連接之原子一起形成雜環或碳環；R4選自由-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR及CQ(R)2組成之群，其中Q為-N(R)2，且n選自1、2、3、4及5；每個R5獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R6獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基及雜芳基；R7選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群；每個R獨立地選自由C1-3烷基、C2-3烯基及H組成之群； 每個R’獨立地選自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每個R”獨立地選自由C3-14烷基及C3-14烯基組成之群；每個R*獨立地選自由C1-12烷基及C1-12烯基組成之群；每個Y獨立地為C3-6碳環；每個X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構體。 |
| [0571] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(IA)之彼等化合物：  或其鹽或異構體，其中l係選自1、2、3、4及5；m係選自5、6、7、8及9；M1為一鍵或M’；R4為未經取代之C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q為OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R2及R3獨立地選自由H、C1-14烷基及C2-14烯基組成之群。 |
| [0572] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(II)之彼等化合物： 或其鹽或異構體，其中l係選自1、 2、3、4及5；M1為一鍵或M’；R4為未經取代之C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n為2、3或4，且Q為OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R2及R3獨立地選自由H、C1-14烷基及C2-14烯基組成之群。 |
| [0573] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)之彼等化合物：    或  或其鹽或異構體，其中R4如本文所述。 |
| [0574] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(IId)之彼等化合物：  或其鹽或異構體，其中n為2、3或4；且m、R’、R”及R2至R6如本文所述。例如，R2與R3各自可獨立地選自由C5-14烷基及C5-14烯基組成之群。 |
| [0575] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)之彼等化合物：    或  或其鹽或異構體，其中R4如本文所述。 |
| [0576] | 在一些實施例中，一子集之式(I)化合物包括式(IId)之彼等化合物：  或其鹽或異構體，其中n為2、3或4；且m、R’、R”及R2至R6如本文所述。例如，R2與R3各自可獨立地選自由C5-14烷基及C5-14烯基組成之群。 |
| [0577] | 在一些實施例中，式(I)化合物係選自以下組成之群：                                                             及  |
| [0578] | 在其他實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：   ，及  |
| [0579] | 在一些實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：                                                                                                                                                                         及其鹽及異構體。 |
| [0580] | 在一些實施例中，奈米粒子包含以下化合物：  或其鹽及異構體。 |
| [0581] | 在一些實施例中，本發明之特徵在於一種包括包含如本文所述之化合物(例如，根據式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物)之脂質組分的奈米粒子組合物。 |
| [0582] | 在一些實施例中，本發明之特徵在於一種包含根據前述實施例之奈米粒子組合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。例如，醫藥組合物經冷藏或冷凍以供儲存及/或運輸(例如，儲存在4℃或4℃以下之溫度下，諸如約-150℃與約0℃之間約-80℃與約-20℃之間之溫度(例如，約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或 -150℃)。例如，醫藥組合物為例如在約-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏以供儲存及/或運輸之溶液。 |
| [0583] | 在一些實施例中，本發明提供一種向細胞(例如，哺乳動物細胞)傳遞治療劑及/或預防劑(例如，RNA，諸如mRNA)之方法。該方法包括向個體(例如，哺乳動物，諸如人類)投與包括(i)包括磷脂(諸如聚不飽和脂質)、PEG脂質、結構脂質及式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之脂質組分及(ii)治療劑及/或預防劑的奈米粒子組合物之步驟，其中投藥包涵使細胞與奈米粒子組合物接觸，由此向細胞傳遞治療劑及/或預防劑。 |
| [0584] | 在一些實施例中，本發明提供一種在細胞(例如，哺乳動物細胞)中產生所關注多肽之方法。該方法包括使細胞與包括(i)包括磷脂(諸如聚不飽和脂質)、PEG脂質、結構脂質及式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之脂質組分及(ii)編碼所關注多肽之mRNA的奈米粒子組合物接觸之步驟，由此使mRNA能夠在細胞中經轉譯而產生多肽。 |
| [0585] | 在一些實施例中，本發明提供一種治療有此需要之哺乳動物(例如，人類)之疾病或病症之方法。該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包括(i)包括磷脂(諸如聚不飽和脂質)、PEG脂質、結構脂質及式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之脂質組分及(ii)治療劑及/或預防劑(例如，mRNA)的奈米粒子組合物之步驟。在一些實施例中，疾病或病症之特徵在於功能不良或異常之蛋白或多肽活性。例如，疾病或病症選自由以下組成之群：罕見疾病、傳染病、癌症及增殖性疾病、遺傳病(例如，囊腫纖維化)、自體免疫疾病、糖尿病、神經退化性疾病、心血管及腎血管疾病及代謝性疾病。 |
| [0586] | 在一些實施例中，本發明提供一種向哺乳動物器官(例如， 肝、脾、肺或股骨)傳遞(例如，特定傳遞)治療劑及/或預防劑之方法。該方法包括向個體(例如，哺乳動物)投與包括(i)包括磷脂、PEG脂質、結構脂質及式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之脂質組分及(ii)治療劑及/或預防劑(例如，mRNA)的奈米粒子組合物之步驟，其中投藥包涵使細胞奈米粒子組合物接觸，由此將治療劑及/或預防劑傳遞至標靶器官(例如，肝、脾、肺或股骨)。 |
| [0587] | 在一些實施例中，本發明之特徵在於一種向標靶組織(例如，肝、脾、肺或股骨)增強傳遞治療劑及/或預防劑(例如，mRNA)之方法。該方法包括向個體(例如，哺乳動物)投與奈米粒子組合物，該組合物包括(i)包括式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物、磷脂、結構脂質及PEG脂質之脂質組分；及(ii)治療劑及/或預防劑，該投藥包括使標靶組織與奈米粒子組合物接觸，由此將治療劑及/或預防劑傳遞至標靶組織。 |
| [0588] | 在一些實施例中，本發明之特徵在於一種降低免疫原性之方法，其包括將本發明之奈米粒子組合物引入細胞中，其中與由包含參考脂質而非式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之參考組合物誘發細胞中之細胞免疫反應相比，奈米粒子組合物使得誘發細胞對奈米粒子組合物之細胞免疫反應減少。例如，細胞免疫反應為先天免疫反應、適應性免疫反應或兩者。 |
| [0589] | 本發明亦包括合成式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之方法及製備包括包含式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)之化合物之脂質組分之奈米粒子組合物的方法。 |
| [0590] | 疫苗投與模式 |
| [0591] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可藉由產生治療有效結果之任何途徑來投與。該等途徑包括(但不限於)皮內、肌肉內及/或皮下投藥。本發明提供包括向有此需要之個體投與RNA(例如，mRNA)疫苗之方法。所需確切量將視個體之物種、年齡及一般病況、疾病之嚴重性、特定組合物、其投藥模式、其活性模式及其類似因素而在個體之間變化。呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物通常調配為單位劑型以便於投藥及劑量之均一性。然而應瞭解，RNA(例如，mRNA)疫苗組合物之每日總用量可由主治醫師在合理醫學判斷之範疇內決定。對於任何特定患者之特異性治療有效、預防有效或適當想象劑量水準將取決於各種因素，包括受治療之病症及病症之嚴重性；所採用特定化合物之活性；所採用之特定組合物；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投藥時間、投藥途徑及所採用特定化合物之排泄速率；治療之持續時間；與所採用特定化合物組合或同步使用之藥物及醫學技術中熟知之類似因素。 |
| [0592] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以足以按個體體重計傳遞0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg之劑量水準每天、每週、每月等投與一或多次來獲得所需之治療、診斷、預防或想像作用(參見例如國際公開案第WO2013078199號中所述之單位劑量範圍，該國際公開案以全文引用之方式併入本文中)。所需劑量可按每天三次、每天兩次、每天一次、每個一天、每三天、每週、每兩週、每三週、每四週、每2個月、每三個月、每6 個月等來傳遞。在一些實施例中，所需劑量可使用多次投藥來傳遞(例如，兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或十四次以上投藥)。當採用多次投藥時，可使用諸如本文所述之彼等分開給藥方案。在例示性實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可按足以傳遞0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如約0.0005mg/kg至約0.0075mg/kg，例如約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kg或約0.005mg/kg之劑量水準來投與。 |
| [0593] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可按足以傳遞0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg之劑量水準投與一次或兩次(或兩次以上)。 |
| [0594] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可按0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg之總劑量或按足以傳遞0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、 0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg之總劑量之劑量水準投與兩次(例如，第0天及第7天、第0天及第14天、第0天及第21天、第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第90天、第0天及第120天、第0天及第150天、第0天及第180天、第0天及3個月後、第0天及6個月後、第0天及9個月後、第0天及12個月後、第0天及18個月後、第0天及2年後、第0天及5年後或第0天及10年後)。本發明涵蓋更高及更低之投藥劑量及頻率。例如，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可投與三次或四次。 |
| [0595] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可按0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg之總劑量或按足以傳遞0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg之總劑量之劑量水準投與兩次(例如，第0天及第7天、第0天及第14天、第0天及第21天、第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第90天、第0天及第120天、第0天及第150天、第0天及第180天、第0天及3個月後、第0天及6個月後、第0天及9個月後、第0天及12個月後、第0天及18個月後、第0天及2年後、第0天及5年後或第0天及10年後)。 |
| [0596] | 在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗係以10μg/kg與400μg/kg之間之核酸疫苗之單次劑量(有效對個體進行疫苗接種之量)向個體投與。在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之RNA(例如，mRNA)疫苗係以10μg與400μg之間之核酸疫苗之單次劑量(有效對個體進行疫苗接種之量)向個體投與。在一些實施例中， 用於對個體進行疫苗接種之方法中之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗係以25至1000μg之單次劑量(例如，單次劑量之編碼hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV抗原之mRNA)向個體投與。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗係以25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg之單次劑量向個體投與。例如，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗可按25至100、25至500、50至100、50至500、50至1000、100至500、100至1000、250至500、250至1000或500至1000μg之單次劑量向個體投與。在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗係以兩次劑量向個體投與，兩次劑量之組合等同於25至1000μg之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗。 |
| [0597] | 本文所述之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗醫藥組合物可經調配為本文所述之劑型，諸如鼻內、氣管內或可經注射(例如，靜脈內、眼內、玻璃體內、肌肉內、皮內、心臟內、腹膜內及皮下)。 |
| [0598] | 呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗調配物及使用方法 |
| [0599] | 本發明之一些態樣提供呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之調配物，其中RNA(例如，mRNA)疫苗以在個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量調配(例如，產生對hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV抗原性多肽具有特異性之抗體)。「有效量」為有效產生抗原特異性免疫反應之RNA(例如，mRNA)疫苗之劑量。本文亦提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法。 |
| [0600] | 在一些實施例中，藉由量測在投與了如本文提供之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗-hMPV、抗-PIV3、 抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽抗體效價來表徵抗原特異性免疫反應。抗體效價為對個體中之抗體量的量測，該等抗體例如對特定抗原(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)或抗原之抗原決定基具有特異性之抗體。抗體效價通常表述為提供一種正結果之最大稀釋度的倒數。酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)為一種例如用於確定抗體效價之常用分析。 |
| [0601] | 在一些實施例中，抗體效價用於評估個體是否感染或確定是否需要免疫。在一些實施例中，抗體效價用於確定自體免疫反應之強度、確定是否需要補強劑免疫、確定先前之疫苗是否有效及識別任何最近或先前之感染。根據本發明，抗體效價可用於確定由呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗在個體中誘發之免疫反應的強度。 |
| [0602] | 在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價相對於對照值而言增加了至少1 log。例如，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3 log。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了1、1.5、2、2.5或3 log。在一些實施例中，在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了1至3 log。例如，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言可增加1至1.5、1至2、1至2.5、1至3、1.5至2、1.5至2.5、1.5至3、2至2.5、2至3或2.5至3 log。 |
| [0603] | 在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗 體效價相對於對照值而言增加了至少2倍。例如，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了2至10倍。例如，在個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言可增加2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9或9至10倍。 |
| [0604] | 在一些實施例中，對照值為在未投與本發明之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。在一些實施例中，對照值為在投與了活減毒hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。減毒疫苗為藉由減小活疫苗(活的)之毒性所產生之疫苗。減毒病毒以使其相對於活的未經修飾病毒而言無害或毒性較小之方式進行改變。在一些實施例中，對照值為在投與了不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。在一些實施例中，對照值為在投與了重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗- RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。重組蛋白疫苗通常包括在異源表現系統(例如，細菌或酵母)中產生或由大量病原有機體純化之蛋白抗原。在一些實施例中，對照值為在已經投與了hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。例如，用作對照物之hMPV VLP疫苗可為藉由在懸浮液適應性人類胚胎腎上皮(293-F)細胞中表現病毒蛋白所產生之包含病毒基質(M)及融合(F)蛋白(或由病毒基質(M)與融合(F)蛋白組成之)hMPV VLP(參見例如Cox RG等人，J Virol.2014年6月；88(11)：6368-6379，其內容以引用之方式併入本文中)。 |
| [0605] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為與重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量相比減低之劑量。如本文提供之「醫療常規」係指醫學或心理學治療準則且可為一般性或特異性的。「醫療常規」基於在對給定病況之治療中涉及之醫學專業之間的科學證據及協作來規定適當之治療。其係醫師/臨床醫師對於特定類型之患者、疾病或臨床情形應遵循之診斷及治療過程。如本文提供之「醫療常規劑量」係指醫師/臨床醫師或其他醫學專業人員將投與個體來治療或預防hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV或hMPV、PIV3、RSV、MeV-及/或βCoV相關病況，同時遵循用於治療或預防hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV或hMPV、PIV3、RSV、MeV-及/或βCoV-相關病況之醫療常規準則的重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之劑量。 |
| [0606] | 在一些實施例中，在投與了有效量之呼吸道病毒RNA(例 如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽(例如，抗-hMPV、抗-PIV3、抗-RSV、抗-MeV及/或抗-βCoV抗原性多肽)抗體效價。 |
| [0607] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等同於比醫療常規劑量之重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗減低至少2倍之劑量。例如，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量可為等同於比重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍之劑量。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等同於比重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低至少100倍、至少500倍或至少1000倍之劑量。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等同於比重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、250、500或1000倍之劑量。在一些實施例中，在投與了有效量之呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組或蛋白hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為 等同於比重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低2倍至1000倍(例如，2倍至100倍、10倍至1000倍)之劑量，其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0608] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等同於比重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低2至1000、2至900、2至800、2至700、2至600、2至500、2至400、2至300、2至200、2至100、2至90、2至80、2至70、2至60、2至50、2至40、2至30、2至20、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至1000、3至900、3至800、3至700、3至600、3至500、3至400、3至300、3至200、3至100、3至90、3至80、3至70、3至60、3至50、3至40、3至30、3至20、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至1000、4至900、4至800、4至700、4至600、4至500、4至400、4至300、4至200、4至100、4至90、4至80、4至70、4至60、4至50、4至40、4至30、4至20、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、4至4、5至1000、5至900、5至800、5至700、5至600、5至500、5至400、5至300、5至200、5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至20、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至1000、6至900、6至800、6至700、6至600、6至500、6至400、6至300、6至200、6至100、6至90、6至80、6至70、6至60、6至50、6至40、6至30、6至20、6至10、6至9、6至8、6至7、7至1000、7至900、7至800、7至700、7至600、7至 500、7至400、7至300、7至200、7至100、7至90、7至80、7至70、7至60、7至50、7至40、7至30、7至20、7至10、7至9、7至8、8至1000、8至900、8至800、8至700、8至600、8至500、8至400、8至300、8至200、8至100、8至90、8至80、8至70、8至60、8至50、8至40、8至30、8至20、8至10、8至9、9至1000、9至900、9至800、9至700、9至600、9至500、9至400、9至300、9至200、9至100、9至90、9至80、9至70、9至60、9至50、9至40、9至30、9至20、9至10、10至1000、10至900、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、10至20、20至1000、20至900、20至800、20至700、20至600、20至500、20至400、20至300、20至200、20至100、20至90、20至80、20至70、20至60、20至50、20至40、20至30、30至1000、30至900、30至800、30至700、30至600、30至500、30至400、30至300、30至200、30至100、30至90、30至80、30至70、30至60、30至50、30至40、40至1000、40至900、40至800、40至700、40至600、40至500、40至400、40至300、40至200、40至100、40至90、40至80、40至70、40至60、40至50、50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至 90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至800、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至1000倍之劑量。在一些實施例中，在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。在一些實施例中，有效量為等同於(或等同於至少)比重組hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗之醫療常規劑量減低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、1280、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、4360、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、5760、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000倍之劑量。在一些實施例中， 在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了醫療常規劑量之重組或純化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV蛋白疫苗或活減毒或不活化hMPV、PIV3、RSV、MeV及/或βCoV疫苗之對照個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0609] | 在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為50至1000μg之總劑量。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至900、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至1000μg之總劑量。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有 效量為50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為25至500μg之劑量，向個體投與總計兩次。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為25至500、25至400、25至300、25至200、25至100、25至50、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、100至500、100至400、100至300、100至200、150至500、150至400、150至300、150至200、200至500、200至400、200至300、250至500、250至400、250至300、300至500、300至400、350至500、350至400、400至500或450至500μg之劑量，向個體投與總計兩次。在一些實施例中，呼吸道病毒RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg之總劑量，向個體投與總計兩次。 |
| [0610] | 本發明之其他實施例之實例 |
| [0611] | 以下編號段落涵蓋本發明之其他實施例： |
| [0612] | 1.一種呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種選自人類偏肺病毒(hMPV)抗原性多肽或其免疫原性片段、人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3)抗原性多肽或其免疫原性片段、呼吸道融合病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原性片段、麻疹病毒(MeV)抗原性多肽或其免疫原性片段及β冠狀病毒(βCoV)抗原性多肽或其免疫原性片段之抗原性多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 |
| [0613] | 2.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段及PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或 至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0614] | 3.段落2之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0615] | 4.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段及RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0616] | 5.段落4之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0617] | 6.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或 其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0618] | 7.段落6之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0619] | 8.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0620] | 9.段落8之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0621] | 10.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸； 或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0622] | 11.段落之呼吸道病毒疫苗10，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0623] | 12.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0624] | 13.段落12之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0625] | 14.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或 至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0626] | 15.段落14之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0627] | 16.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0628] | 17.段落之呼吸道病毒疫苗16，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0629] | 18.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼RSV抗原性多肽或其 免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0630] | 19.段落18之呼吸道病毒疫苗，其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0631] | 20.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種RNA聚核苷酸，一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0632] | 21.段落20之呼吸道病毒疫苗，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0633] | 22.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原 性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0634] | 23.段落22之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0635] | 24.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0636] | 25.段落24之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0637] | 26.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0638] | 27.段落26之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0639] | 28.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0640] | 29.段落28之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包 含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0641] | 30.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0642] | 31.段落30之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0643] | 32.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性 多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0644] | 33.段落32之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0645] | 34.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0646] | 35.段落34之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺 基酸序列。 |
| [0647] | 36.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0648] | 37.段落36之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0649] | 38.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0650] | 39.段落38之呼吸道病毒疫苗，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0651] | 40.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種或三種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0652] | 41.段落40之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：23至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0653] | 42.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之 RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種或四種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0654] | 43.段落42之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0655] | 44.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種或四種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0656] | 45.段落44之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包 含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0657] | 46.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種或四種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0658] | 47.段落46之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺 基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0659] | 48.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種或四種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0660] | 49.段落48之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0661] | 50.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片 段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種或四種RNA聚核苷酸，一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0662] | 51.段落50之呼吸道病毒疫苗，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0663] | 52.段落1之呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸；或至少兩種、三種、四種或五種RNA聚核苷酸，一種具有編碼hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架、一種具有編碼MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架且一 種具有編碼βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 |
| [0664] | 53.段落52之呼吸道病毒疫苗，其中該hMPV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該PIV3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，其中該MeV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列，且/或其中該βCoV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列或與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少90%或95%之一致性之胺基酸序列。 |
| [0665] | 54.段落1至53中任一項之疫苗，其中至少一種RNA聚核苷酸與野生型mRNA序列具有小於80%之一致性。 |
| [0666] | 55.段落1至53中任一項之疫苗，其中至少一種RNA聚核苷酸與野生型mRNA序列具有至少80%之一致性，但不包括野生型mRNA序列。 |
| [0667] | 56.段落1至55中任一項之疫苗，其中至少一種抗原性多肽具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 |
| [0668] | 57.段落1至56中任一項之疫苗，其中至少一種RNA聚核苷酸包含至少一個化學修飾。 |
| [0669] | 58.段落57之疫苗，其中該化學修飾係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、 2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2’-O-甲基尿苷。 |
| [0670] | 59.段落57或58之疫苗，其中該化學修飾位於該尿嘧啶之第5位。 |
| [0671] | 60.段落57至59中任一項之疫苗，其中該化學修飾為N1-甲基假尿苷。 |
| [0672] | 61.段落57至60中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架中至少80%、至少90%或100%之尿嘧啶具有化學修飾。 |
| [0673] | 62.段落1至61中任一項之疫苗，其中至少一種RNA聚核苷酸進一步編碼至少一個5'端帽，視情況其中該5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。 |
| [0674] | 63.段落1至62中任一項之疫苗，其中至少一種抗原性多肽或其免疫原性片段與選自以下之信號肽融合：HuIgGk信號肽(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQ ID NO：15)；IgE重鏈ε-1信號肽(MDWTWILFLVAAATRVHS；SEQ ID NO：16)；日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：17)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：18)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：19)。 |
| [0675] | 64.段落63之疫苗，其中該信號肽與至少一種抗原性多肽之N末端或C末端融合。 |
| [0676] | 65.段落1至64中任一項之疫苗，其中該抗原性多肽或其免疫原性片段包含突變N連接之醣基化位點。 |
| [0677] | 66.段落1至65中任一項之疫苗，其經調配在奈米粒子中，該奈米粒子視情況為脂質奈米粒子。 |
| [0678] | 67.段落66之疫苗，其中該脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質；視情況其中該脂質奈米粒子載劑包含約20至60%陽離子脂質、0.5至15%經PEG改質之脂質、25至55%固醇及25%非陽離子脂質之莫耳比；視情況其中該陽離子脂質為可電離之陽離子脂質且該非陽離子脂質為中性脂質，且該固醇為膽固醇；且視情況其中該陽離子脂質係選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。 |
| [0679] | 68.之段落66或67疫苗，其中該奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)包含式(I)及/或式(II)之化合物，視情況為化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112或122。 |
| [0680] | 69.段落1至68中任一項之疫苗，其進一步包含佐劑，視情況為視情況包含由SEQ ID NO：54至56中任一者標識之胺基酸序列之鞭毛蛋白或肽。 |
| [0681] | 70.段落1至69中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架經密碼子最佳化。 |
| [0682] | 71.段落1至70中任一項之疫苗，其以有效產生抗原特異性免疫反應之量調配。 |
| [0683] | 72.一種在個體中誘發免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與在該個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量的段落1至71中任一項之疫苗。 |
| [0684] | 73.段落72之方法，其中向該個體投與單次劑量之疫苗或其中向該個體投與第一劑量且隨後投與補強劑量之該疫苗。 |
| [0685] | 74.段落72或73之方法，其中藉由皮內注射或肌肉內注射向該個體投與該疫苗。 |
| [0686] | 75.段落72至74中任一項之方法，其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少1 log，且/或其中在該個體中產生之該抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少2倍。 |
| [0687] | 76.段落72至75中任一項之方法，其中該對照值為在未投與針對該病毒之疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價，且/或其中該對照值為在已經投與針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價，及/或其中該對照值為在已經投與針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價，且/或其中該對照值為在已經投與針對該病毒之VLP疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0688] | 77.段落72至76中任一項之方法，其中該有效量為等同於針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在分別投與了該醫療常規劑量之針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價；且/或其中該有效量為等同於針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在分別投與了該醫療常規劑量之針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價；且/或其中該有效量為等同於針對該病毒之VLP疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了該醫療常 規劑量之針對該病毒之VLP疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價。 |
| [0689] | 78.段落72至77中任一項之方法，其中該有效量為50μg至1000μg之總劑量，視情況其中該有效量為總計兩次向該個體投與之25μg、100μg、400μg或500μg之劑量。 |
| [0690] | 79.段落72至78中任一項之方法，其中該疫苗針對該病毒之功效大於65%；且/或其中該疫苗使該個體對該病毒免疫持續長達2年或其中該疫苗使該個體對該病毒免疫持續2年以上。 |
| [0691] | 80.段落72至79中任一項之方法，其中該個體年齡為約5歲大或5歲以下或其中該個體年齡為約60歲大或60歲以上；及/或其中該個體患有慢性肺病；及/或該個體已暴露於該病毒，其中該個體感染該病毒或其中該個體存在受該病毒感染之風險；且/或其中該個體免疫功能不足。 |
| [0692] | 81.段落1至71中任一項之呼吸道病毒疫苗，其包含至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)具有編碼至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)選自以下之抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸：hMPV抗原性多肽(SEQ ID NO：5至8)、PIV3抗原性多肽(SEQ ID NO：12至13)、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽(SEQ ID NO：47至50)及βCoV抗原性多肽(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1；(SEQ ID NO：24至34))，其經調配在如下之陽離子脂質奈米粒子中：(a)具有約20至60%陽離子脂質、約5至25%非陽離子脂質、約25至55%固醇及約0.5至15%經PEG改質之脂質之莫耳比，且/或(b)包含式(I)及/或式(II)之化合物， 其中該至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)RNA聚核苷酸包含至少一個化學修飾。 |
| [0693] | 82.段落1至71中任一項之呼吸道病毒疫苗，其包含至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)具有編碼至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)選自以下之抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸：hMPV抗原性多肽(SEQ ID NO：5至8)、PIV3抗原性多肽(SEQ ID NO：12至13)、RSV抗原性多肽、MeV抗原性多肽(SEQ ID NO：47至50)及βCoV抗原性多肽(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1；(SEQ ID NO：24至34))，其經調配在如下之陽離子脂質奈米粒子中：(a)具有約20至60%陽離子脂質、約5至25%非陽離子脂質、約25至55%固醇及約0.5至15%經PEG改質之脂質之莫耳比，且/或(b)包含至少一種(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種)選自化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112及122之化合物。 |
| [0694] | 83.段落81或82之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自hMPV抗原性多肽(例如，SEQ ID NO：5至8)。 |
| [0695] | 84.段落81至83中任一項之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自PIV3抗原性多肽(例如，SEQ ID NO：12至13)。 |
| [0696] | 85.段落81至84中任一項之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自RSV抗原性多肽。 |
| [0697] | 86.段落81至85中任一項之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自MeV抗原性多肽(例如，SEQ ID NO：47至 50)。 |
| [0698] | 87.段落81至86中任一項之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自βCoV抗原性多肽(例如，SEQ ID NO：24至34)。 |
| [0699] | 88.段落87之呼吸道病毒疫苗，其中該βCoV抗原性多肽為MERS抗原性多肽。 |
| [0700] | 89.段落87之呼吸道病毒疫苗，其中該βCoV抗原性多肽為SARS抗原性多肽。 |
| [0701] | 90.段落81至89中任一項之呼吸道病毒疫苗，其中該至少一種(例如，至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種)RNA聚核苷酸包含至少一個化學修飾(例如，選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2’-O-甲基尿苷)。 |
| [0702] | 91.一種呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有5’端帽、編碼至少一種呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架及3’聚腺苷酸尾之信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸。 |
| [0703] | 92.段落91之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含由SEQ ID NO：57至80中任一者標識之序列。 |
| [0704] | 93.段落91或92之疫苗，其中該5’端帽為或包含7mG(5')ppp(5')NlmpNp。 |
| [0705] | 94.段落91至93中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架中 100%之尿嘧啶經修飾為在該尿嘧啶之第5位包括N1-甲基假尿苷。 |
| [0706] | 95.段落91至94中任一項之疫苗，其中該疫苗經調配在包含以下之脂質奈米粒子中：DLin-MC3-DMA；膽固醇；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)；及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。 |
| [0707] | 96.段落95之疫苗，其中該脂質奈米粒子進一步包含檸檬酸三鈉緩衝液、蔗糖及水。 |
| [0708] | 97.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種具有5’端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、由SEQ ID NO：57至80中任一者標識之序列及3’聚腺苷酸尾之信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其經調配在包含以下之脂質奈米粒子中：DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG，其中由SEQ ID NO：57至80中任一者標識之該序列之該等尿嘧啶核苷酸經修飾而在該尿嘧啶核苷酸之第5位包括N1-甲基假尿苷。 |
| [0709] | 本發明在其申請案中不限於下文描述中所述或圖式中說明之構築詳情及組分配置。本發明能夠具有其他實施例且能夠以各種方式實踐或進行。又，本文所用之片語及術語係為描述之目的且不應理解為限制。本文中使用「包括」、「包含」或「具有」、「含有」、「涵蓋」及其變化形式欲涵蓋下文所列之項目及其等效形式以及其他項目。 |
| [0710] | 實例1：製造聚核苷酸 |
| [0711] | 根據本發明，可利用標題為「Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts」之國際公開案WO2014/152027中教示之方法來實現製造聚核苷酸及/或其部分或區域，該國際公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0712] | 純化方法可包括國際公開案WO2014/152030及國際公開案WO2014/152031中教示之彼等方法，該等國際公開案各自以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0713] | 聚核苷酸之偵測及表徵方法可如國際公開案WO2014/144039中教示來進行，該國際公開案以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0714] | 表徵本發明之聚核苷酸可使用聚核苷酸定位、逆轉錄酶測序、電荷分佈分析、偵測RNA雜質或兩種或兩種以上上述方法之任意組合來實現。「表徵」包括例如測定RNA轉錄物序列、測定RNA轉錄物之純度或測定RNA轉錄物之電荷異質性。該等方法例如在國際公開案WO2014/144711及國際公開案WO2014/144767中教示，該等國際公開案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 |
| [0715] | 實例2：嵌合聚核苷酸合成 |
| [0716] | 根據本發明，嵌合聚核苷酸之兩個區域或部分可使用三磷酸酯化學物連接或接合。100個或100個以下核苷酸之第一區域或部分例如由5’單磷酸酯及末端3’desOH或阻斷OH化學合成。若該區域長於80個核苷酸，則其可合成為用於接合之兩股。 |
| [0717] | 若第一區域或部分經使用活體外轉錄(IVT)而合成為非定位修飾之區域或部分，則隨後可由3’末端之後續封端來轉化5’單磷酸酯。 |
| [0718] | 單磷酸酯保護基可選自此項技術中已知之彼等單磷酸酯保護基中之任一者。 |
| [0719] | 嵌合聚核苷酸之第二區域或部分可使用化學合成或IVT方法來合成。IVT方法可包括可利用具有經修飾端帽之引子的RNA聚合酶。或者，具有多達130個核苷酸之端帽可化學合成並與IVT區域或部分偶合。 |
| [0720] | 對於接合方法而言，由DNA T4接合酶接合，繼而由DNA酶處理應易於避免串接。 |
| [0721] | 整個嵌合聚核苷酸無需由磷酸酯-糖骨架來製造。若該等區域或部分之一編碼多肽，則該等區域或部分可包含磷酸酯-糖骨架。 |
| [0722] | 隨後使用任何已知之鍵擊化學、鄰位鍵擊化學、溶聯(solulink)或熟習此項技術者已知之其他生物結合化學方法來進行接合。 |
| [0723] | 合成途徑 |
| [0724] | 可使用一系列起始區段來製備嵌合聚核苷酸。該等區段包括： |
| [0725] | (a)封端且受保護之5’區段，其包含正常3’OH(SEG.1) |
| [0726] | (b)5’三磷酸酯區段，其可包括多肽之編碼區及正常3’OH(SEG.2) |
| [0727] | (c)用於包含蟲草素之嵌合聚核苷酸3’末端(例如，尾部)或無3’OH(SEG.3)之5’單磷酸酯區段 |
| [0728] | 在合成(化學或IVT)之後，可以蟲草素處理區段3(SEG.3)且隨後以焦磷酸酶處理以產生5'單磷酸酯。 |
| [0729] | 隨後可使用RNA接合酶使區段2(SEG.2)接合至SEG.3。接合之聚核苷酸隨後經純化且以焦磷酸酶處理來裂解二磷酸酯。隨後可純化經處理之SEG.2-SEG.3構築體且使SEG.1接合至5’末端。可進行嵌合聚核苷酸之進一步純化步驟。 |
| [0730] | 當嵌合聚核苷酸編碼多肽時，接合或連接區段可表示為：5’UTR(SEG.1)、開放閱讀框架或ORF(SEG.2)及3'UTR+PolyA(SEG.3)。 |
| [0731] | 每一步驟之產率可至多為90至95%。 |
| [0732] | 實例3：用於cDNA生產之PCR |
| [0733] | 使用Kapa Biosystems(Woburn,MA)之2×KAPA HIFITM HotStart ReadyMix進行用於製備cDNA之PCR程序。此系統包括2×KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引子(10μM)0.75μl；反向引子(10μM)0.75μl；模板cDNA 100ng；及稀釋至25.0μl之dH20。反應條件可為在95℃下歷時5分鐘。反應可進行25個如下循環：在98℃下歷時20秒鐘、隨後在58℃下歷時15秒鐘、隨後在72℃下歷時45秒鐘、隨後在72℃下歷時5分鐘、隨後在4℃下至結束。 |
| [0734] | 根據製造商之說明，使用Invitrogen之PURELINKTM PCR微套組(Carlsbad,CA)清理反應(至多5μg)。較大之反應可需要使用具有較大容量之產品來清理。清理之後，可使用NANODROPTM對cDNA定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認cDNA為預期大小。隨後可提交cDNA用於測序分析，之後繼續進行活體外轉錄反應。 |
| [0735] | 實例4：活體外轉錄(IVT) |
| [0736] | 活體外轉錄反應產生RNA聚核苷酸。該等聚核苷酸可包含本發明之聚核苷酸之區域或部分，包括經化學修飾之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。經化學修飾之RNA聚核苷酸可為經均勻修飾之聚核苷酸。活體外轉錄反應利用核苷酸三磷酸酯(NTP)之定製混合物。NTP可包含經化學修飾之NTP，或天然與經化學修飾之NTP之混合物，或天然NTP。 |
| [0737] | 一種典型之活體外轉錄反應包括以下： |
| [0738] | 1)模板cDNA 1.0μg |
| [0739] | 2)10×轉錄緩衝液 2.0μl |
| [0740] | (400mM Tris-HCl pH 8.0、190mM MgCl2、50 mM DTT、10mM亞精胺) |
| [0741] | 3)定製NTP(各25mM) 0.2μl |
| [0742] | 4)RNA酶抑制劑 20U |
| [0743] | 5)T7 RNA聚合酶 3000U |
| [0744] | 6)dH20 至多20.0μl.及 |
| [0745] | 7)在37℃下培育3小時至5小時。 |
| [0746] | 粗IVT混合物可在4℃下儲存隔夜以供次日清理。隨後可使用1U之無RNA酶的DNA酶來消化初始模板。在37℃下培育15分鐘後，可根據製造商之說明使用Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)來純化mRNA。此套組可純化多達500μg RNA。清理之後，可使用NanoDrop對RNA聚核苷酸定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認RNA聚核苷酸為適當大小且RNA未發生降解。 |
| [0747] | 實例5：酶促封端 |
| [0748] | 如下對RNA聚核苷酸進行封端，其中該混合物包括：60μg至180μg之IVT RNA及多達72μl之dH20。將混合物在65℃下培育5分鐘以使RNA變性，且隨後即刻轉移至冰中。 |
| [0749] | 實驗方案則包涵：將10×封端緩衝液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、60mM KCl、12.5mM MgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷醯基甲硫胺酸(2.5μl)；RNA酶抑制劑(100U)；2'-O-甲基轉移酶(400U)；牛痘封端酶(鳥苷醯基轉移酶)(40U)；dH20(多達28μl)混合；且對於60μg RNA而言在37℃下培育30分鐘或對於180μg RNA而言在37℃下培育持續達2小時。 |
| [0750] | 隨後可根據製造商之說明，使用Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)來純化RNA聚核苷酸。清理之後，可使用NANODROPTM(ThermoFisher,Waltham,MA)對RNA定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認RNA聚核苷酸為適當大小且RNA未 發生降解。亦可藉由運行逆相轉錄PCR來對RNA聚核苷酸產物進行測序以產生用於測序之cDNA。 |
| [0751] | 實例6：聚腺苷酸加尾反應 |
| [0752] | 在cDNA中無聚-T時，在清理最終產物之前必須進行聚腺苷酸加尾反應。此藉由將封端IVT RNA(100μl)；RNA酶抑制劑(20U)；10×加尾緩衝液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；聚腺苷酸聚合酶(20U)；多達123.5μl之dH20混合且在37℃下培育30min來進行。若聚腺苷酸尾已在轉錄物中，則可跳過加尾反應且直接進行以Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)清理(多達500μg)。聚腺苷酸聚合酶可為在酵母中表現之重組酶。 |
| [0753] | 應瞭解，聚腺苷酸加尾反應之持續性或完整性並非總是產生確切尺寸之聚腺苷酸尾。因此，約40至200個核苷酸，例如約40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150至165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165個核苷酸之聚腺苷酸尾在本發明之範疇內。 |
| [0754] | 實例7：天然5'端帽及5'端帽類似物 |
| [0755] | 在活體外轉錄反應期間，可根據製造商之方案使用以下化學RNA端帽類似物產生5'-鳥苷端帽結構來同時完成對聚核苷酸之5'-封端：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA端帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New英格蘭BioLabs,Ipswich,MA)。經修飾RNA之5'-封端可在轉錄後使用牛痘病毒封端酶來完成以產生「端帽0」結構：m7G(5')ppp(5')G(New英格蘭BioLabs,Ipswich,MA)。端帽1結構可使用牛痘病毒封端酶及2'-O甲基-轉移酶產生以產生：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲 基。端帽2結構可由端帽1結構產生，繼而使用2'-O甲基-轉移酶對5'-倒數第三個核苷酸進行2'-O-甲基化。端帽3結構可由端帽2結構產生，繼而使用2'-O甲基-轉移酶對5'-倒數第四個核苷酸進行2'-O-甲基化。酶較佳源自重組來源。 |
| [0756] | 當轉染至哺乳動物細胞中時，經修飾之mRNA具有12至18小時之間或大於18小時，例如24、36、48、60、72或大於72小時之穩定性。 |
| [0757] | 實例8：封端分析 |
| [0758] | 蛋白表現分析 |
| [0759] | 本文中教示之含有任意端帽、編碼多肽之聚核苷酸(例如，mRNA)可在相同濃度下轉染至細胞中。可在轉染後6、12、24及/或36小時由ELISA來分析分泌至培養基中之蛋白的量。向培養基中分泌較高水準蛋白之合成性聚核苷酸對應於具有較高轉譯感受態端帽結構之合成性聚核苷酸。 |
| [0760] | 純度分析合成 |
| [0761] | 可使用變性瓊脂糖-尿素凝膠電泳或HPLC分析來比較本文中教示之含有任意端帽、編碼多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的純度。藉由電泳而具有單一合併波段之RNA聚核苷酸對應於與具有多個波段或拖尾波段之聚核苷酸相比具有較高純度之產物。具有單一HPLC峯之經化學修飾之RNA聚核苷酸亦對應於較高純度之產物。具有較高效率之封端反應提供更純之聚核苷酸群體。 |
| [0762] | 細胞激素分析 |
| [0763] | 本文中教示之含有任意端帽、編碼多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸可在多種濃度下轉染至細胞中。可在轉染後6、12、24及/或36小時由ELISA來分析分泌至培養基中之促炎性細胞激素(諸如TNF-α及IFN-β)之量。導致向培養基中分泌較高水準促 炎性細胞激素之RNA聚核苷酸對應於含有免疫活性端帽結構之聚核苷酸。 |
| [0764] | 封端反應效率 |
| [0765] | 在核酸酶處理後，藉由LC-MS分析本文中教示之含有任意端帽、編碼多肽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸的封端反應效率。核酸酶處理封端聚核苷酸產生由LC-MS可偵測之游離核苷酸與封端5'-5-三磷酸酯端帽結構之混合物。LC-MS光譜上封端產物之量可表述為來自反應之總聚核苷酸之百分比且對應於封端反應效率。藉由LC-MS，具有較高封端反應效率之端帽結構具有較高之封端產物量。 |
| [0766] | 實例9：經修飾之RNA或RT PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳 |
| [0767] | 根據製造商實驗方案，可將個別RNA聚核苷酸(200至400ng，體積為20μl)或逆轉錄PCR產物(200至400ng)負載於非變性1.2%瓊脂糖E-凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上之孔中且運行12至15分鐘。 |
| [0768] | 實例10：Nanodrop經修飾之RNA定量及UV光譜資料 |
| [0769] | TE緩衝液(1μl)中經化學修飾之RNA聚核苷酸用於Nanodrop UV吸光度讀數以定量來自化學合成或活體外轉錄反應之每種聚核苷酸之產率。 |
| [0770] | 實例11：使用類脂質調配經修飾之mRNA |
| [0771] | 在添加至細胞中之前，藉由將聚核苷酸與類脂質以固定比率混合，可將RNA(例如，mRNA)聚核苷酸調配用於活體外實驗。活體內調配物可能需要添加額外成分已促使在整個體內循環。為測試該等類脂質形成適合活體內運作之粒子的能力，可使用用於siRNA-類脂質調配物之標準調配方法作為起始點。形成粒子之後，添加聚核苷酸且使其與複合物整合。使用標準染料排除分析 來測定囊封效率。 |
| [0772] | 實例12：免疫原性研究 |
| [0773] | 設計本研究來測試候選hMPV疫苗在小鼠中之免疫原性，該等候選hMPV疫苗包含由hMPV獲得之編碼融合(F)醣蛋白、主要表面醣蛋白G或其組合之mRNA聚核苷酸。 |
| [0774] | 經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以候選疫苗對小鼠進行免疫。候選疫苗為經化學修飾或未經修飾。以3週之間隔(亦即，在第0週、第3週、第6週及第9週)給予總計四次免疫，且在每次免疫後收集血清直至第33至51週。藉由ELISA測定針對融合(F)醣蛋白或主要表面醣蛋白(G)蛋白之血清抗體效價。將在第10至16週期間自每隻小鼠收集之血清彙集，且純化總IgG。經純化之抗體用於免疫電子顯微法、抗體親和力測試及活體外保護分析。 |
| [0775] | 實例13：hMPV囓齒動物攻毒 |
| [0776] | 設計本研究以使用由hMPV獲得之包含編碼融合(F)醣蛋白、主要表面醣蛋白G或兩種抗原之組合之mRNA的hMPV疫苗來測試候選hMPV疫苗在棉鼠中針對致命攻毒之功效。以致命劑量之hMPV對棉鼠進行攻毒。 |
| [0777] | 在第0週及第3週，經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以具有及不具有佐劑之候選hMPV疫苗對動物進行免疫。候選疫苗為經化學修飾或未經修飾。隨後在第7週經由IV、IM或ID以致命劑量之hMPV對動物進行攻毒。終點為感染後第13天、死亡或安樂死。對如由體重減輕>30%、極度嗜睡或麻痹確定之展現嚴重疾病之動物施以安樂死。每日評估並記錄體溫及體重。 |
| [0778] | 在使用脂質奈米粒子(LNP)調配物之實驗中，調配物可包括比率為50：10：1.5：38.5之陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及 結構脂質。例如，陽離子脂質為DLin-KC2-DMA(50mol%)或DLin-MC3-DMA(50mol%)，非陽離子脂質為DSPC(10mol%)，PEG脂質為PEG-DOMG(1.5mol%)且結構脂質為膽固醇(38.5mol%)。 |
| [0779] | 實例14：hMPV mRNA疫苗在BALB/c小鼠中之免疫原性 |
| [0780] | 設計本研究來測試hMPV疫苗在BALB/c小鼠中之免疫原性，該等hMPV疫苗包含編碼hMPV融合(F)醣蛋白之mRNA聚核苷酸。mRNA聚核苷酸編碼全長融合蛋白且包含由hMPV A2a菌株獲得之野生型核苷酸序列。將小鼠分為3組(每組n=8)且以PBS、10μg劑量之編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗或2μg劑量之編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗經肌肉內(IM)進行免疫。以3週之間隔(亦即，在第0週及第3週)給予總計兩次免疫，且根據表1中所述之方案在每次免疫後收集血清。藉由ELISA測定針對hMPV融合醣蛋白之血清抗體效價且在向前第14天收集之血清中偵測抗體。所測試之兩種疫苗劑量在小鼠中誘發相當水準之免疫反應(圖2A至2C)。 |
| [0781] | 另外，小鼠血清用於IgG分型(圖3A至3C)。在小鼠血清中偵測兩種hMPV融合蛋白特異性IgG1及IgG2a。hMPV融合蛋白mRNA疫苗亦誘發Th1及Th2細胞激素反應，其中具有Th1偏差。 |
| [0782] | 來自經10μg或2μg劑量之hMPV融合蛋白mRNA疫苗進行免疫之小鼠的血清含有中和抗體。亦測試該等抗體中和hMPV B2菌株之能力。含抗體之血清成功地中和hMPV B2病毒(圖4)。 |
| [0783] | 實例15：T-細胞刺激 |
| [0784] | 如本文所述，設計本研究來測試在經編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗進行免疫之小鼠之脾細胞中的T-細胞刺激。如實例14中所述對BALB/c小鼠進行免疫。彙集各組之脾細胞且分為兩個部 分。以不含hMPV之介質、伴刀豆球蛋白A或包含15聚體(15個胺基酸長)之hMPV融合蛋白肽匯集物來刺激一部分來自每組小鼠之脾細胞；而以不含hMPV之介質、伴刀豆球蛋白A或不活化hMPV病毒來刺激另一部分來自每組小鼠之脾細胞。使用中尺度發現(Meso Scale Discovery，MSD)分析量測所分泌之小鼠細胞激素。 |
| [0785] | 量測對Th1或Th2反應具有特異性之細胞激素。對於Th1反應而言，由以與伴刀豆球蛋白A相當之水準經hMPV融合蛋白肽匯集物刺激之脾細胞來偵測IFN-γ、IL2及IL12(圖5A至5C)。對於Th2反應而言，hMPV融合蛋白肽匯集物誘發分泌可偵測之IL10、TNF-α、IL4及IL，但不分泌IL5，而伴刀豆球蛋白A刺激以高得多之水準分泌所有上文提及之Th2細胞激素(圖6A至6E)。 |
| [0786] | 相反，不活化hMPV病毒僅在Th1反應中誘發與伴刀豆球蛋白A相當之IL2分泌(圖7A至7C)。對於Th2反應而言，不活化hMPV病毒誘發分泌可偵測之IL10、TNF-α、IL4及IL6，但不分泌IL5，而伴刀豆球蛋白A刺激以高得多之水準分泌所有上文提及之Th2細胞激素(圖8A至8E)。 |
| [0787] | 實例16：在經編碼hMPV融合蛋白之mRN4疫苗進行免疫之棉鼠中之hMPV囓齒動物攻毒 |
| [0788] | 設計本研究來測試hMPV疫苗在棉鼠中針對致命攻毒之功效。使用編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗。mRNA聚核苷酸編碼全長融合蛋白且包含由hMPV A2a菌株獲得之野生型核苷酸序列。 |
| [0789] | 在第0週及第3週經肌肉內(IM)以編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗對棉鼠進行免疫，每次免疫為2μg或10μg劑量。隨後在經由IV、IM或ID進行初始免疫後第7週，以致命劑量之hMPV對動物進行攻毒。終點為感染後第13天、死亡或安樂死。量測棉鼠之鼻 及肺中之病毒效價。結果(圖9A及9B)展示10μg劑量之mRNA疫苗100%保護棉鼠之肺且在攻毒後使鼻中之病毒效價劇烈減低(減低約2 log)。此外，2μg劑量之mRNA疫苗展示經攻毒棉鼠之肺病毒效價減低1 log。 |
| [0790] | 此外，經免疫及攻毒之棉鼠之肺的組織病理學未展示與疫苗增強疾病相關之病理(圖10)。 |
| [0791] | 實例17：免疫原性研究 |
| [0792] | 設計本研究來測試候選PIV3疫苗在小鼠中之免疫原性，該等候選PIV3疫苗包含由PIV3獲得之編碼血球凝集素-神經胺糖酸酶或融合蛋白(F或F0)之mRNA聚核苷酸。 |
| [0793] | 經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以候選疫苗對小鼠進行免疫。候選疫苗為經化學修飾或未經修飾。以3週之間隔(亦即，在第0週、第3週、第6週及第9週)給予總計四次免疫，且在每次免疫後收集血清直至第33至51週。藉由ELISA測定針對血球凝集素-神經胺糖酸酶或融合蛋白(F或F0)之血清抗體效價。將在第10至16週期間自每隻小鼠收集之血清視情況彙集，且純化總IgG。經純化之抗體用於免疫電子顯微法、抗體親和力測試及活體外保護分析。 |
| [0794] | 實例18：PIV3囓齒動物攻毒 |
| [0795] | 設計本研究以使用由PIV3獲得之包含編碼血球凝集素-神經胺糖酸酶或融合蛋白(F或F0)之mRNA的PIV3疫苗來測試候選PIV3疫苗在棉鼠中針對致命攻毒之功效。以致命劑量之PIV3對棉鼠進行攻毒。 |
| [0796] | 在第0週及第3週，經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以具有及不具有佐劑之候選PIV3疫苗對動物進行免疫。候選疫苗為經化學修飾或未經修飾。隨後在第7週經由IV、IM或ID以致命劑 量之PIV3對動物進行攻毒。終點為感染後第13天、死亡或安樂死。對如由體重減輕>30%、極度嗜睡或麻痹確定之展現嚴重疾病之動物施以安樂死。每日評估並記錄體溫及體重。 |
| [0797] | 在使用脂質奈米粒子(LNP)調配物之實驗中，調配物可包括比率為50：10：1.5：38.5之陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。例如，陽離子脂質為DLin-KC2-DMA(50mol%)或DLin-MC3-DMA(50mol%)，非陽離子脂質為DSPC(10mol%)，PEG脂質為PEG-DOMG(1.5mol%)且結構脂質為膽固醇(38.5mol%)。 |
| [0798] | 實例19：hMPV/PIV棉鼠攻毒 |
| [0799] | 設計本研究以使用PIV3菌株或hMPV/A2菌株來測試候選hMPV mRNA疫苗、PIV3 mRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗在棉鼠中針對致命攻毒之功效。研究設計展示於表9中。 |
| [0800] | 將10至12週之棉鼠分為12組(n=5)，且以表9中所示之mRNA疫苗對每組進行疫苗接種。PIV3疫苗包含由PIV3獲得之編碼血球凝集素-神經胺糖酸酶或融合蛋白(F或F0)之mRNA。hMPV mRNA疫苗編碼全長hMPV融合蛋白。hMPV/PIV組合mRNA疫苗為PIV3疫苗與hMPV疫苗以1：1比率之混合物。 |
| [0801] | 在第0週及第3週，經肌肉內(IM)以表9中所示劑量之候選疫苗對棉鼠進行免疫。在第7週經由IM以致命劑量之hMPV/A2菌株對經hMPV mRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗進行免疫之棉鼠進行攻毒。在第7週經由IM以致命劑量之PIV3菌株對經PIVmRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗進行免疫之棉鼠進行攻毒。 |
| [0802] | 終點為感染後第13天、死亡或安樂死。對如由體重減輕>30%、極度嗜睡或麻痹確定之展現嚴重疾病之動物施以安樂 死。每日評估並記錄體溫及體重。 |
| [0803] | 評估肺及鼻hMPV/A2(圖12)或PIV3(圖13)病毒效價。評估經免疫及攻毒之棉鼠之組織病理學以確定與疫苗增強疾病相關之病理學。評估在免疫後第0天及第42天，經免疫棉鼠血清中之中和抗體效價(圖11)。 |
| [0804] | 量測免疫後42天之經免疫棉鼠血清樣本中之hMPV/A2(圖14)或PIV3(圖15)中和抗體效價。經測試之所有mRNA疫苗均誘發強中和抗體棉鼠。亦評估經免疫棉鼠之肺組織病理學(圖16)。觀測到低發生率之肺泡炎及間質性肺炎，表明hMPV或PIV相關疾病無抗體依賴性之增強(ADE)。 |
| [0805] | 實例20：β冠狀病毒免疫原性研究 |
| [0806] | 設計本研究以測試候選β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1或其組合)疫苗在兔中之免疫原性，該等疫苗包含由β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)獲得之編碼刺突(S)蛋白、刺突蛋白之S1次單位(S1)或刺突蛋白之S2次單位(S2)之mRNA聚核苷酸。 |
| [0807] | 在第0週及第3週經由靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)途徑對兔進行疫苗接種。一組仍未經疫苗接種，且一組經投與不活化之β冠狀病毒。在第1週、第3週(預先劑量)及第5週自每隻兔收集血清。經由來自所有三個時間點之病毒中和分析來測試個別出血之抗-S、抗-S1或抗-S2活性，且藉由西方墨點法使用不活化β冠狀病毒(例如，不活化MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)來測試僅來自第5週之彙集樣本。 |
| [0808] | 在使用脂質奈米粒子(LNP)調配物之實驗中，調配物可包括比率為50：10：1.5：38.5之陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。例如，陽離子脂質為DLin-KC2-DMA(50mol%)或DLin-MC3-DMA(50mol%)，非陽離子脂質為DSPC(10mol%)，PEG脂質為PEG-DOMG(1.5mol%)且結構脂質為膽固醇(38.5mol%)。 |
| [0809] | 實例21：β冠狀病毒攻毒 |
| [0810] | 設計本研究以使用由β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)獲得之包含編碼刺突(S)蛋白、刺突蛋白之S1次單位(S1)或刺突蛋白之S2次單位(S2)之mRNA的β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1或其組合)疫苗來測試候選β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1或其組合)疫苗在兔中針對致命攻毒之功效。以致命劑量(10×LD90；約100個斑塊形成單位；PFU)之β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)對兔進行攻毒。 |
| [0811] | 所用動物為分為10組之6至8週大之雌性兔。在第0週及第3週經由IM、ID或IV投藥途徑對兔進行疫苗接種。候選疫苗為經化學修飾或未經修飾。測試兔血清之微中和(參見實例14)。隨後在第7週經由IN、IM、ID或IV投藥途徑以約1 LD90之β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)對兔進行攻毒。終點為感染後第13天、死亡或安樂死。對如由體重減輕>30%、極度嗜睡或麻痹確定之展現嚴重疾病之動物施以安樂死。每日評估並 記錄體溫及體重。 |
| [0812] | 實例22：微中和分析 |
| [0813] | 在96孔微量滴定盤中，在具有胰蛋白酶之50μl病毒生長培養基(VGM)中製備9份連續2倍稀釋(1：50至1：12,800)之兔血清。向血清稀釋液中添加50微升含有約50pfu之β冠狀病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-NL、HCoV-NH或HCoV-HKU1)之病毒且使其在室溫(RT)下培育60分鐘。在每個培養盤上一式三份地包括不含血清之病毒陽性對照孔及不具有病毒或血清之陰性對照孔。當血清-病毒混合物培育時，藉由胰蛋白酶化(Gibco 0.5%牛胰腺酶胰蛋白酶在EDTA中)長滿單層來製備Madin-Darby犬-腎細胞之單一細胞懸浮液且將懸浮細胞轉移至50ml離心管中，頂上加蓋無菌PBS且輕柔混合。隨後將細胞以200g粒化5分鐘、抽出上清液且將細胞再懸浮於PBS中。將此程序重複一次且以3×105/ml之濃度將細胞再懸浮於具有豬胰蛋白酶之VGM中。隨後，向血清-病毒混合物中添加100μl細胞且將培養盤在CO2中在35℃下培育5天。在室溫下將培養盤以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中80%之丙酮固定持續15分鐘、風乾且隨後以含有0.5%明膠及2%FCS之PBS阻斷30分鐘。將S蛋白、S1蛋白或S2蛋白之抗體在具有0.5%明膠/2%FCS/0.5%吐溫20之PBS中稀釋且在室溫下培育2小時。將孔洗滌且添加辣根過氧化物酶-結合之山羊抗小鼠IgG，繼而再培育2小時。洗滌之後，添加O-苯二胺二鹽酸鹽且中和效價定義為使顯色與陽性對照孔相比減低50%之血清效價。 |
| [0814] | 實例23：小鼠中之MERS CoV疫苗免疫原性研究 |
| [0815] | 設計本研究來測試候選MERS-CoV疫苗在小鼠中之免疫原性，該等候選MERS-CoV疫苗包含由MERS-CoV獲得之編碼全長 刺突(S)蛋白或刺突蛋白之S2次單位(S2)之mRNA聚核苷酸。 |
| [0816] | 在第0天及第21天，以10μg劑量之編碼全長MERS-CoV刺突(S)蛋白或刺突蛋白之S2次單位(S2)之MERS-CoV mRNA疫苗來對小鼠進行疫苗接種。在第0天、第21天、第42天及第56天自每隻小鼠收集血清。經由來自所有四個時間點之病毒中和分析來測試個別出血之抗-S、抗-S2活性。 |
| [0817] | 如圖17中所示，編碼全長S蛋白之MERS-CoV疫苗在第21天補強劑量後誘發強免疫反應。此外，與單獨之S2相比，全長S蛋白疫苗產生高得多之中和抗體效價(圖18)。 |
| [0818] | 實例24：紐西蘭白兔中之MERS CoV疫苗免疫原性研究 |
| [0819] | 設計本研究來測試編碼全長刺突(S)蛋白之候選MERS-CoV mRNA疫苗之免疫原性。此研究中所用之紐西蘭白兔體重約4至5kg。將兔分為三組(第1a組、第1b組及第2組，n=8)。在第0天，以一次20μg劑量之編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗經肌肉內(IM)對第1a組中之兔進行免疫。在第0天，以一次20μg劑量之編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗經肌肉內(IM)對第1b組中之兔進行免疫，且在第21天再次進行免疫(補強劑量)。第2組接受安慰劑(PBS)。隨後對經免疫之兔進行攻毒且在攻毒後4天收集樣本。例如經由定量PCR測定兔之肺、支氣管肺泡灌洗(Bal)、鼻及喉中之病毒負載。亦偵測兔之肺組織中之複製病毒。評估肺組織病理學且測定兔之血清樣品中之中和抗體效價。 |
| [0820] | 兩次20μg劑量之MERS-CoV mRNA疫苗使鼻中之病毒負載減低3 log且導致對紐西蘭白兔之喉之完全保護(圖19A)。兩次20μg劑量之MERS-CoV mRNA疫苗亦導致紐西蘭白兔之BAL中之病毒負載減低4 log(圖19B)。一次20μg劑量之MERS-CoV mRNA疫苗導致紐西蘭白兔之肺中之病毒負載減低2 log，而兩次20μg劑量 之MERS-CoV mRNA疫苗導致病毒負載減低超過4 log(圖19C)。 |
| [0821] | 定量PCR結果表明，兩次20μg劑量之MERS-CoV mRNA疫苗使紐西蘭白兔之肺中之病毒減低超過99%(2 log)(圖20A)。在肺中未偵測到複製病毒(圖20B)。 |
| [0822] | 此外，如圖21中所示，兩次20μg劑量之MERS-CoV mRNA疫苗誘發顯著量之針對MERS-CoV之中和抗體(EC50在500至1000之間)。MERS-CoV mRNA疫苗誘發之抗體效價比在同一模型中測試之任何其他疫苗更佳3至5倍。 |
| [0823] | 實例25：免疫原性研究 |
| [0824] | 設計本研究來測試候選MeV疫苗在小鼠中之免疫原性，該等候選MeV疫苗包含編碼MeV血球凝集素(HA)蛋白、MeV融合(F)蛋白或兩者組合之mRNA聚核苷酸。 |
| [0825] | 經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以候選疫苗對小鼠進行免疫。以3週之間隔(亦即，在第0週、第3週、第6週及第9週)給予至多三次免疫，且在每次免疫後收集血清直至第33週至第51週。藉由ELISA測定針對MeV HA蛋白或MeV F蛋白之血清抗體效價。 |
| [0826] | 實例26：MeV囓齒動物攻毒 |
| [0827] | 設計本研究以使用包含編碼MeV HA蛋白或MeV F蛋白之mRNA之MeV疫苗來測試候選MeV疫苗在轉基因小鼠中針對致命攻毒之功效。轉基因小鼠表現人類受體CD46或信號轉導淋巴細胞活化分子(SLAM)(亦稱為CD150)。人類為MeV感染之唯一天然宿主，因此此研究需要轉基因品系。CD46為一種藉由結合至補體組分C3b及C4b來保護宿主組織免於補體沈積之補體調節蛋白。其在鼠類纖維母細胞及淋巴細胞株上之表現使得該等其他難治性細胞允許MeV感染，且CD46在靈長類動物細胞上之表現使人類與非人 類靈長類動物中之MeV感染的臨狀趨性平行(Rall GF等人PNAS USA 1997；94(9)：4659-63)。SLAM為屬於免疫球蛋白首科之1型膜醣蛋白。其在活化淋巴細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞之表面上表現，且認為在淋巴細胞之信號轉導中具有重要作用。SLAM為一種用於野生型及疫苗MeV菌株之受體(Sellin CI等人J Virol.2006；80(13)：6420-29)。 |
| [0828] | 以致命劑量之MeV對CD46或SLAM/CD150轉基因小鼠進行攻毒。在第0週及第3週經靜脈內(IV)、肌肉內(IM)或皮內(ID)以具有及不具有佐劑之候選MeV疫苗對動物進行免疫。隨後在第7週經由IV、IM或ID以致命劑量之MeV對動物進行攻毒。終點為感染後第13天、死亡或安樂死。對如由體重減輕>30%、極度嗜睡或麻痹確定之展現嚴重疾病之動物施以安樂死。每日評估並記錄體溫及體重。 |
| [0829] | 在使用脂質奈米粒子(LNP)調配物之實驗中，調配物可包括比率為50：10：1.5：38.5之陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG脂質及結構脂質。例如，陽離子脂質為DLin-KC2-DMA(50mol%)，非陽離子脂質為DSPC(10mol%)，PEG脂質為PEG-DOMG(1.5mol%)且結構脂質為膽固醇(38.5mol%)。 |
| [0830] |  |
| [0831] | 總計n=24 |
| [0832] | 本文所述之每種序列涵蓋經化學修飾之序列或不包括化學修飾之未經修飾之序列。 |
| [0833] |           |
| [0834] |   |
| [0835] |           |
| [0836] |            |
| [0837] |   |
| [0838] |        |
| [0839] |  |
| [0840] |  |
| [0841] | 表10.β冠狀病毒核酸序列                    |
| [0842] |         |
| [0843] |        |
| [0844] |                                |
| [0845] |    |
| [0846] |             |
| [0847] |         |
| [0848] |   |
| [0849] |        |
| [0850] |                                              |
| [0851] | 熟習此項技術者將意識到，或使用不超出常規之實驗即能夠確認本文所述本發明之特定實施例之多種等效形式。該等等效形式意欲由以下申請專利範圍所涵蓋。 |
| [0852] | 本文揭示之所有參考文獻，包括專利文件，均以全文引用之方式併入。 |
| 【圖式簡單說明】 | |
| [0137] | 如附圖中說明，上述及其他目標、特徵及優勢將由本發明之特定實施例之以下描述中顯而易見，在附圖中，相同之參考符號在不同視圖中係指相同之部件。該等繪圖並非必然按比例繪製，相反基於說明本發明之各種實施例之原則而進行強調。 |
| [0138] | 圖1展示本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗構築體之一種實例的示意圖。構築體描繪由野生型菌株獲得之人類偏肺病毒及人類呼吸道融合病毒全長融合蛋白(The Journal of General Virology.2008；89(Pt 12)：3113-3118，其以引用之方式併入本文中)。 |
| [0139] | 圖2A至2C為展示在免疫後，在第0天(圖2A)、第14天(圖2B)及第35天(圖2C)以hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠血清中之抗-hMPV融合蛋白特異性抗體之水準的圖表。在第0天以單次劑量(2μg或10μg)對小鼠進行免疫且在第21天給予補強劑量(2μg或10μg)。對於兩種劑量而言，均在第35天以高達1：10000之血清稀釋比偵測hMPV融合蛋白特異性抗體。 |
| [0140] | 圖3A至3C為展示經hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠血清中之IgG分型結果的圖表。藉由ELISA量測血清中hMPV融合蛋白特異性IgG2a(圖3A)及IgG1(圖3B)抗體之水準。圖3C展示hMPV融合蛋白mRNA疫苗誘發混合Th1/Th2細胞激素反應，伴有Th1偏 差。 |
| [0141] | 圖4為展示使用經編碼hMPV融合蛋白之mRNA疫苗進行免疫之小鼠血清對hMPV B2菌株(TN/91-316)進行活體外中和之圖表。由接受10μg或2μg劑量之小鼠獲得之小鼠血清含有hMPV-中和抗體。 |
| [0142] | 圖5A至5C為展示在由經hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠分離之脾細胞中，由hMPV融合肽匯集物(15-mers-5O(重疊))誘發之Th1細胞激素反應的圖表。使用無病毒介質作為陰性對照物且包括伴刀豆球蛋白A(ConA，用於脾細胞刺激之陽性對照物)。測試之細胞激素包括IFN-γ(圖5A)、IL-2(圖5B)及IL12(圖5C)。 |
| [0143] | 圖6A至6E為展示在由經hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠分離之脾細胞中，由hMPV融合肽匯集物(15-mers-5O)誘發之Th2細胞激素反應的圖表。使用無病毒介質作為陰性對照物且亦包括伴刀豆球蛋白A。測試之細胞激素包括IL-10(圖6A)、TNF-α(圖6B)、IL4(圖6C)、IL-5(圖6D)及IL-6(圖6E)。 |
| [0144] | 圖7A至7C為展示在由經hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠分離之脾細胞中，由不活化hMPV病毒誘發之Th1反應的圖表。使用無病毒介質作為陰性對照物且包括伴刀豆球蛋白A。測試之細胞激素包括IFN-γ(圖7A)、IL-2(圖7B)及IL12(圖7C)。 |
| [0145] | 圖8A至8E為展示在由經hMPV mRNA疫苗進行免疫之小鼠分離之脾細胞中，由不活化hMPV病毒誘發之Th2反應的圖表。使用無病毒介質作為陰性對照物且包括伴刀豆球蛋白A。測試之細胞激素包括IL-10(圖8A)、TNF-α(圖8B)、IL4(圖8C)、IL-5(圖8D)及IL-6(圖8E)。 |
| [0146] | 圖9A至9B為展示棉鼠攻毒實驗結果之圖表。在攻毒之前，使用兩種不同劑量之hMPV mRNA疫苗(2μg或10μg劑量)來對棉鼠 進行免疫。hMPV mRNA疫苗使得棉鼠肺及鼻中之病毒效價減低，10μg劑量對於減低病毒效價更為有效。使用10μg劑量導致對肺之100%保護且使鼻之病毒效價減低約2 log。使用2μg劑量導致肺之病毒效價減低1 log且鼻之病毒效價未減低。在第0天投與疫苗，且在第21天投與補強劑。 |
| [0147] | 圖10為展示接受hMPV mRNA疫苗之棉鼠之肺組織病理的圖表。在免疫組中未觀測到與疫苗增強疾病相關之病理。 |
| [0148] | 圖11為展示在免疫後第35天及第42天接受hMPV mRNA疫苗(2μg或10μg劑量)之棉鼠體內之hMPV中和抗體效價的圖表。 |
| [0149] | 圖12為展示在經所述mRNA疫苗(hMPV mRNA疫苗或hMPV/PIV mRNA組合疫苗)進行免疫後，以hMPV/A2菌株進行攻毒之棉鼠體內之肺及鼻病毒負載的圖表。經疫苗接種之棉鼠在攻毒後與對照值相比，展示肺及鼻病毒負載減低。 |
| [0150] | 圖13為展示在經所述mRNA疫苗(PIV mRNA疫苗或hMPV/PIV組合疫苗)進行免疫後，以PIV3菌株進行攻毒之棉鼠體內之肺及鼻病毒負載的圖表。經疫苗接種之棉鼠在攻毒後與對照值相比，展示肺及鼻病毒負載減低。 |
| [0151] | 圖14為展示在免疫後第42天接受不同劑量hMPV mRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗之棉鼠體內之hMPV中和抗體效價的圖表。疫苗之劑量在表9中指出。 |
| [0152] | 圖15為展示在免疫後第42天接受不同劑量PIV mRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗之棉鼠體內之PIV3中和抗體效價的圖表。疫苗之劑量在表9中指出。 |
| [0153] | 圖16為展示經如表9所示之hMPV mRNA疫苗、PIV mRNA疫苗或hMPV/PIV組合mRNA疫苗進行免疫之棉鼠之肺組織病理學計分的圖表。觀測到低發生率之肺泡炎及間質性肺炎，表明hMPV 相關疾病並無抗體依賴性增強(ADE)。 |
| [0154] | 圖17為展示在免疫後第0天、第21天、第42天及第56天，經編碼MERS-CoV全長刺突蛋白之β冠狀病毒mRNA疫苗免疫之小鼠中之倒數MERS-CoV中和抗體效價的圖表。 |
| [0155] | 圖18為展示經編碼MERS-CoV全長刺突蛋白或刺突蛋白之S2次單位之β冠狀病毒mRNA疫苗免疫之小鼠中之倒數MERS-CoV中和抗體效價的圖表。全長刺突蛋白與單獨之S2次單位相比誘發更強之免疫反應。 |
| [0156] | 圖19A至19C為展示在經MERS-CoV攻毒後4天時，紐西蘭白兔之鼻喉、支氣管肺泡灌洗(BAL)或肺部中之病毒負載的圖表。在攻毒之前，以一次20μg劑量(在第0天)或兩次20μg劑量(在第0天及第21天)之編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗對紐西蘭白兔進行免疫。圖19A展示兩次劑量之MERS-CoV mRNA疫苗導致鼻中之病毒負載減低3 log且導致對紐西蘭白兔之喉部的完全保護。圖19B展示兩次劑量之MERS-CoV mRNA疫苗導致紐西蘭白兔之BAL中之病毒負載減低4 log。圖19C展示一次劑量之MERS-CoV mRNA疫苗導致病毒負載減低2 log，而兩次劑量之MERS-CoV mRNA疫苗導致紐西蘭白兔之肺中之病毒負載減低超過4 log。 |
| [0157] | 圖20A至20B為展示在經MERS-CoV攻毒後4天時，在紐西蘭白兔之肺中由PCR偵測之病毒負載或複製病毒的影像及圖表。在攻毒之前以單次20μg劑量(在第0天，第1a組)之編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗、兩次20μg劑量(在第0天及第21天，第1b組)之編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗或安慰劑(第2組)對紐西蘭白兔進行免疫。圖20A展示兩次劑量之20μg MERS-CoV mRNA疫苗使紐西蘭白兔之肺中之病毒減低99%以上 (2 log)。圖20B展示接受2次劑量之20μg MERS-CoV mRNA疫苗之紐西蘭白兔組在其肺中不具有任何可偵測之複製MERS-CoV病毒。 |
| [0158] | 圖21為展示在經編碼全長刺突蛋白之MERS-CoV mRNA疫苗免疫之紐西蘭白兔中之MERS-CoV中和抗體效價的圖表。如圖21A至21C中所述對紐西蘭白兔進行免疫。結果展示兩次劑量之20μg MERS-CoV mRNA疫苗誘發針對MERS-CoV而言顯著量之中和抗體(EC50在500至1000之間)。MERS-CoV mRNA疫苗誘發之抗體效價優於在相同模型中測試之任何其他疫苗3至5倍。 |
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| 申請專利範圍 |
| 1.一種呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸，其調配於陽離子脂質奈米粒子中。 2.如請求項1之呼吸道病毒疫苗，其中該呼吸道病毒係選自人類偏肺病毒(hMPV)、人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3)、呼吸道融合病毒(RSV)、麻疹病毒(MeV)及β冠狀病毒(βCoV)。 3.一種人類偏肺病毒(hMPV)疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 4.如請求項3之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白及SH蛋白。 5.如請求項3或4之疫苗，其中該疫苗包含至少一種具有編碼選自F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白及SH蛋白之至少兩種hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 6.如請求項3至5中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白及SH蛋白之hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之hMPV抗原性多肽與由該等開放閱讀框架中另一者編碼之hMPV抗原性多肽不同。 7.如請求項3至6中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽 包含由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列。 8.如請求項3至7中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽由SEQ ID NO：1至4中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：57至60中任一者標識之核酸序列。 9.如請求項3至8中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 10.如請求項3至9中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：5至8中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 11.如請求項3至10中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 12.如請求項3至11中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 13.一種人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3)疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 14.如請求項13之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白及N蛋白。 15.如請求項13或14之疫苗，其中該疫苗包含至少一種具有編碼至少兩種選自F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白及N蛋白之PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 16.如請求項13至15中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白及N蛋白之PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之PIV3抗原性多肽與由該等開放閱讀框架之另一者編碼之PIV3抗原性多肽不同。 17.如請求項13至16中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽包含由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列。 18.如請求項13至17中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽由SEQ ID NO：9至12中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：61至64中任一者標識之核酸序列。 19.如請求項13至18中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 20.如請求項13至19中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：12至13中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 21.如請求項13至20中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：12至13之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合 及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 22.如請求項13至21中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：12至13之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 23.一種呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種人類偏肺病毒(hMPV)抗原性多肽或其免疫原性片段、至少一種人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3)抗原性多肽或其免疫原性片段及至少一種呼吸道融合病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 24.如請求項23之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白及M蛋白。 25.如請求項23或24之疫苗，其中該疫苗包含至少一種具有編碼至少兩種選自F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白及M蛋白之抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 26.如請求項23至25中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白及M蛋白之抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之抗原性多肽與由該等開放閱讀框架中另一者編碼之抗原性多肽不同。 27.如請求項23至26中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8或12至13中任一者標識之胺基酸 序列。 28.如請求項23至27中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽由SEQ ID NO：1至4或9至12中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：57至60或61至64中任一者標識之核酸序列。 29.如請求項23至28中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：5至8或12至13中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 30.如請求項23至29中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：5至8或12至13中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 31.如請求項23至30中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8或12至13之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 32.如請求項23至31中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8或12至13之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 33.一種麻疹病毒(MeV)疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 34.如請求項33之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白及C蛋白。 35.如請求項33或34之疫苗，其中該疫苗包含至少一種具有編碼至少兩種選自HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白及C蛋白之MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 36.如請求項33至35中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白及C蛋白之MeV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之MeV抗原性多肽與由該等開放閱讀框架中另一者編碼之MeV抗原性多肽不同。 37.如請求項33至36中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽包含由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列。 38.如請求項33至37中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽由SEQ ID NO：35至46中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：69至80中任一者標識之核酸序列。 39.如請求項33至38中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 40.如請求項33至39中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：47至50中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 41.如請求項33至40中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：47至50之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合 及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 42.如請求項33至41中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：47至50之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 43.一種β冠狀病毒(βCoV)疫苗，其包含：至少一種具有編碼至少一種βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架之核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 44.如請求項43之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽係選自S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白。 45.如請求項43或44之疫苗，其中該疫苗包含至少一種具有編碼至少兩種選自S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白之βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 46.如請求項43至45中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白之βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之βCoV抗原性多肽與由該等開放閱讀框架中另一者編碼之βCoV抗原性多肽不同。 47.如請求項43至46中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽包含由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列。 48.如請求項43至47中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽由SEQ ID NO：20至23中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：65至68中任一 者標識之核酸序列。 49.如請求項43至48中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 50.如請求項43至49中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：24至34中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 51.如請求項43至50中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：24至34之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 52.如請求項43至50中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：24至34之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 53.一種呼吸道病毒疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少兩種選自人類偏肺病毒(hMPV)抗原性多肽或其免疫原性片段、人類第3型副流行性感冒病毒(PIV3)抗原性多肽或其免疫原性片段、呼吸道融合病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原性片段、麻疹病毒(MeV)抗原性多肽或其免疫原性片段及β冠狀病毒(βCoV)抗原性多肽或其免疫原性片段之抗原性多肽之開放閱讀框架。 54.如請求項53之疫苗，其中該至少一種hMPV抗原性多肽係選 自F蛋白、G蛋白、M蛋白、P蛋白、N蛋白及SH蛋白；且/或其中至少一種PIV3抗原性多肽係選自F蛋白、HN蛋白、M蛋白、P蛋白及N蛋白；且/或其中至少一種RSV抗原性多肽係選自F蛋白、G蛋白、L蛋白、P蛋白、N蛋白、M2蛋白及M蛋白；且/或其中至少一種MeV抗原性多肽係選自HA蛋白、F蛋白、P蛋白、V蛋白及C蛋白；且/或其中至少一種β-CoV抗原性多肽係選自S蛋白(S、S1及/或S2)、E蛋白、N蛋白及M蛋白。 55.如請求項53之疫苗，其中該疫苗包含至少一種RNA聚核苷酸，其具有編碼至少兩種選自hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。 56.如請求項53至55中任一項之疫苗，其中該疫苗包含至少兩種RNA聚核苷酸，其各自具有編碼至少一種選自hMPV抗原性多肽或其免疫原性片段、PIV3抗原性多肽或其免疫原性片段、RSV抗原性多肽或其免疫原性片段、MeV抗原性多肽或其免疫原性片段及βCoV抗原性多肽或其免疫原性片段之抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，其中由該等開放閱讀框架之一編碼之抗原性多肽與由該等開放閱讀框架中另一者編碼之抗原性多肽不同。 57.如請求項53至56中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽包含由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50中任一者標識之胺基酸序列。 58.如請求項53至57中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA多肽 由SEQ ID NO：1至4、9至12、20至23或35至46中任一者標識之核酸序列編碼，且/或其中該至少一種RNA多肽包含由SEQ ID NO：57至60、61至64、65至68或69至80中任一者標識之核酸序列。 59.如請求項53至58中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與由SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50中任一者標識之胺基酸序列具有至少95%之一致性之胺基酸序列。 60.如請求項53至59中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50中任一者標識之胺基酸序列具有95%至99%之一致性之胺基酸序列。 61.如請求項53至60中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50之胺基酸序列具有至少90%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 62.如請求項53至61中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有與SEQ ID NO：5至8、12至13、24至34或47至50之胺基酸序列具有90%至99%之一致性之胺基酸序列，且其中該抗原性多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 63.如請求項1至62中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸與野生型mRNA序列具有小於80%之一致性。 64.如請求項1至62中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸與野生型mRNA序列具有至少80%之一致性，但不包括野生型mRNA序列。 65.如請求項1至64中任一項之疫苗，其中該至少一種抗原性多肽具有膜融合活性、附著至細胞受體、導致病毒與細胞膜融合及/或負責該病毒與受感染之細胞之結合。 66.如請求項1至65中任一項之疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸包含至少一個化學修飾。 67.如請求項1、2或66之疫苗，其中該化學修飾係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2’-O-甲基尿苷。 68.如請求項66或67之疫苗，其中該化學修飾係位於尿嘧啶之第5位。 69.如請求項66至68中任一項之疫苗，其中該化學修飾為N1-甲基假尿苷。 70.如請求項66至69中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架中至少80%之尿嘧啶具有化學修飾。 71.如請求項70之疫苗，其中該開放閱讀框架中至少90%之尿嘧啶具有化學修飾。 72.如請求項71之疫苗，其中該開放閱讀框架中100%之尿嘧啶具有化學修飾。 73.如請求項1至72中任一項之疫苗，其中至少一種RNA聚核苷 酸進一步編碼至少一個5'端帽。 74.如請求項73之疫苗，其中該5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。 75.如請求項1至74中任一項之疫苗，其中至少一種抗原性多肽或其免疫原性片段與選自以下之信號肽融合：HuIgGk信號肽(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQ ID NO：15)；IgE重鏈ε-1信號肽(MDWTWILFLVAAATRVHS；SEQ ID NO：16)；日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：17)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：18)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：19)。 76.如請求項75之疫苗，其中該信號肽與至少一種抗原性多肽之N末端融合。 77.如請求項75之疫苗，其中該信號肽與至少一種抗原性多肽之C末端融合。 78.如請求項1至77中任一項之疫苗，其中該抗原性多肽或其免疫原性片段包含突變N連接之醣基化位點。 79.如請求項3至78中任一項之疫苗，其經調配在奈米粒子中。 80.如請求項79之疫苗，其中該奈米粒子為脂質奈米粒子。 81.如請求項1、2或80之疫苗，其中該奈米粒子具有50至200nm之平均直徑。 82.如請求項1、2或80之疫苗，其中該脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質。 83.如請求項82之疫苗，其中該脂質奈米粒子載劑包含約20至60%陽離子脂質、0.5至15%經PEG改質之脂質、25至55%固醇及25%非陽離子脂質之莫耳比。 84.如請求項82或83之疫苗，其中該陽離子脂質為可電離之陽離子脂質且該非陽離子脂質為中性脂質，且該固醇為膽固醇。 85.如請求項83或84中任一項之疫苗，其中該陽離子脂質係選自2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)及9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。 86.如請求項80至85中任一項之疫苗，其中該脂質奈米粒子包含式(I)化合物，視情況為化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108至112或122。 87.如請求項80至85中任一項之疫苗，其中該脂質奈米粒子包含式(II)化合物。 88.如請求項1至87中任一項之疫苗，其中該奈米粒子具有小於0.4之多分散性值。 89.如請求項1至88中任一項之疫苗，其中該奈米粒子在中性pH值下具有淨中性電荷。 90.如請求項1至89中任一項之疫苗，其進一步包含佐劑。 91.如請求項90之疫苗，其中該佐劑為鞭毛蛋白或肽。 92.如請求項91之疫苗，其中該鞭毛蛋白或肽包含由SEQ ID NO：54至56中任一者標識之胺基酸序列。 93.如請求項1至92中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架經密碼子最佳化。 94.如請求項1至93中任一項之疫苗，其中該疫苗為多價的。 95.如請求項1至94中任一項之疫苗，其以有效產生抗原特異性免疫反應之量調配。 96.一種在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，該方法包括 向該個體投與在該個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量的如請求項1至95中任一項之疫苗。 97.如請求項96之方法，其中該抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應。 98.如請求項96或97之方法，其中向該個體投與單次劑量之該疫苗。 99.如請求項96或97之方法，其中向該個體投與補強劑量之該疫苗。 100.如請求項96至99中任一項之方法，其中藉由皮內注射或肌肉內注射向該個體投與該疫苗。 101.如請求項96至100中任一項之方法，其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少1 log。 102.如請求項96至100中任一項之方法，其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了1至3 log。 103.如請求項96至102中任一項之方法，其中在該個體中產生之該抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了至少2倍。 104.如請求項96至102中任一項之方法，其中在該個體中產生之該抗-抗原性多肽抗體效價相對於對照值而言增加了2至10倍。 105.如請求項96至104中任一項之方法，其中該對照值為在未投與針對該病毒之疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 106.如請求項96至104中任一項之方法，其中該對照值為在已經投與針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之個體中產生之 抗-抗原性多肽抗體效價。 107.如請求項96至104中任一項之方法，其中該對照值為在已經投與針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 108.如請求項96至104中任一項之方法，其中該對照值為在已經投與針對該病毒之VLP疫苗之個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價。 109.如請求項96至108中任一項之方法，其中該有效量為等同於針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在分別投與了該醫療常規劑量之針對該病毒之重組蛋白疫苗或純化蛋白疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價。 110.如請求項96至108中任一項之方法，其中該有效量為等同於針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在分別投與了該醫療常規劑量之針對該病毒之活減毒疫苗或不活化疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價。 111.如請求項96至108中任一項之方法，其中該有效量為等同於針對該病毒之VLP疫苗之醫療常規劑量減低至少2倍的劑量，且其中在該個體中產生之抗-抗原性多肽抗體效價等同於在投與了該醫療常規劑量之針對該病毒之VLP疫苗之對照個體中產生的抗-抗原性多肽抗體效價。 112.如請求項96至111中任一項之方法，其中該有效量為50μg至1000μg之總劑量。 113.如請求項112之方法，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之25μg、100μg、400μg或500μg之劑量。 114.如請求項96至113中任一項之方法，其中該疫苗針對該病毒之功效大於65%。 115.如請求項96至114中任一項之方法，其中該疫苗使該個體對該病毒免疫持續長達2年。 116.如請求項96至114中任一項之方法，其中該疫苗使該個體對該病毒免疫持續2年以上。 117.如請求項96至116中任一項之方法，其中該個體年齡為約5歲大或5歲以下。 118.如請求項96至116中任一項之方法，其中該個體年齡為約60歲大或60歲以上。 119.如請求項96至118中任一項之方法，其中該個體患有慢性肺病。 120.如請求項96至119中任一項之方法，其中該個體已暴露於該病毒，其中該個體感染該病毒，或其中該個體存在受該病毒感染之風險。 121.如請求項96至120中任一項之方法，其中該個體免疫功能不足。 122.如請求項1至95中任一項之疫苗，其用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中，該方法包括向該個體投與在該個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量的該疫苗。 123.一種如請求項1至95中任一項之疫苗之用途，其用以製造用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中的藥物，該方法包括向該個體投與在該個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量的該疫苗。 124.一種工程化核酸，其編碼如請求項1至95中任一項之疫苗的至少一種RNA聚核苷酸。 |
| 圖式 | |
 圖1  圖2A至2C  圖3A至3C  圖4  圖5A至5C  圖6A至6E  圖7A至7C  圖8A至8E  圖9A至9B  圖10  圖11  圖12  圖13  圖14  圖15  圖16  圖17  圖18  圖19A  圖19B  圖19C  圖20A  圖20B  圖21 |
